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微生物學(xué)實(shí)驗講義
微生物學(xué)實(shí)驗篇一：微生物學(xué)實(shí)驗講義(基礎)
微生物學(xué)類(lèi)實(shí)驗講義
(適用專(zhuān)業(yè)：生物工程、生物技術(shù)、生物科學(xué))
北方民族大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院
2010年制定
1實(shí)驗目錄
微生物學(xué)實(shí)驗規則和安全……………………………………3
實(shí)驗一微生物學(xué)實(shí)驗基本知識與準備………………………………5
實(shí)驗二實(shí)驗三實(shí)驗四實(shí)驗五實(shí)驗六實(shí)驗七實(shí)驗八實(shí)驗九實(shí)驗十顯微鏡油鏡的使用與細菌染色…………………………………10
細菌芽孢、莢膜的染色及其認識………………………………17
顯微鏡測微技術(shù)及細菌運動(dòng)性觀(guān)察……………………………19
酵母菌個(gè)體、群體形態(tài)觀(guān)察，血球板顯微鏡計數技術(shù)…22
放線(xiàn)菌個(gè)體、群體形態(tài)觀(guān)察……………………………………24
霉菌個(gè)體、群體形態(tài)觀(guān)察………………………………………25
培養基的配制及濕熱滅菌，玻璃器皿的干熱滅菌……………27
微生物的分離與純化……………………………………………31
理化因素對微生物生長(cháng)的影響，生長(cháng)譜法測定微生物營(yíng)養要求……33
2微生物學(xué)實(shí)驗規則和安全
普通微生物學(xué)實(shí)驗課的目的是：訓練學(xué)生掌握微生物學(xué)最基本的操作技能，了解微生物學(xué)的基本知識，加深理解課堂講授的某些微生物學(xué)理論。同時(shí)，通過(guò)實(shí)驗，培養學(xué)生觀(guān)察、思考、提出問(wèn)題、分析問(wèn)題和解決問(wèn)題的能力，實(shí)事求是、嚴肅認真的科學(xué)態(tài)度以及敢于創(chuàng )新的開(kāi)拓精神；樹(shù)立勤儉節約、愛(ài)護公物的`良好作風(fēng)。
微生物學(xué)實(shí)驗室是一個(gè)嚴肅的實(shí)驗場(chǎng)所，雖然普通微生物學(xué)實(shí)驗所用的微生物材料一般為非致病菌或條件致病菌，但許多微生物是否具有致病性不是絕對的，與其數量、條件、感染途徑等有關(guān)，所以在實(shí)驗操作中，必須將所有的微生物培養物都看成是具有潛在致病性的。
3為了上好微生物學(xué)實(shí)驗課，并保證安全，特制定如下規則和安全措施：
1．每次實(shí)驗前必須對實(shí)驗內容進(jìn)行充分預習，以了解實(shí)驗的目的、原理和方法，做到心中有數，思路清楚。
2．在整個(gè)實(shí)驗過(guò)程中必須穿上實(shí)驗服，留長(cháng)發(fā)者，必須將長(cháng)發(fā)挽在背后。實(shí)驗臺上除了記錄本和筆(記錄筆和記號筆)以外，不準堆放任何個(gè)人物品。
3．認真及時(shí)做好實(shí)驗記錄，對于當時(shí)不能得到結果而需要連續觀(guān)察的實(shí)驗，則需記下每次觀(guān)察的現象和結果，以便分析。
4．實(shí)驗室內應保持整潔，勿高聲談話(huà)和隨便走動(dòng)，保持室內安靜。
5．實(shí)驗時(shí)小心仔細，全部操作應嚴格按照操作規程進(jìn)行，禁止用嘴吸取菌液或試劑，萬(wàn)一遇有盛菌試管或瓶不慎打破、皮膚破傷等意外情況發(fā)生時(shí)，應立即報告指導教師，及時(shí)處理，切勿隱瞞。
6．實(shí)驗過(guò)程中，切勿使乙醇(酒精)乙醚、丙酮等易燃藥品接近火焰。如遇火險，應先關(guān)掉火源，再用濕布或沙土掩蓋滅火。必要時(shí)用滅火器。
7．使用顯微鏡或其他貴重儀器時(shí)，要求細心操作，特別愛(ài)護。顯微鏡的目鏡在使用前后必須用浸有乙醇(酒精)的透鏡紙擦凈。對消耗材料和藥品等要力求節約，用畢后仍放回原處，嚴禁將藥匙交叉使用。
8．每次實(shí)驗完畢后，必須把所用儀器抹凈放妥，將實(shí)驗室收拾整齊，擦凈桌面，如有菌液污染桌面或其他地方時(shí)，可用3%來(lái)蘇爾液或5%石炭酸液覆蓋半小時(shí)后擦去，如系芽孢桿菌，應適當延長(cháng)消毒時(shí)間。凡帶菌之工具(如吸管、玻璃刮棒等)在洗滌前須浸泡在3%來(lái)蘇爾液中進(jìn)行消毒。
9．每次實(shí)驗需進(jìn)行培養的材料，應標明自己的組別及處理方法，放于教師指定的地點(diǎn)進(jìn)行培養。實(shí)驗室中的菌種和物品等，未經(jīng)教師許可，不得攜出室外。
10．每次實(shí)驗的結果，應以實(shí)事求是的科學(xué)態(tài)度填入報告表格中，力求簡(jiǎn)明準確，認真回答思考題，并及時(shí)匯交教師批閱。
11．離開(kāi)實(shí)驗室前將手洗凈，注意關(guān)閉門(mén)窗、燈、火、煤氣等。
4實(shí)驗一微生物學(xué)實(shí)驗基本知識與準備
一、目的要求
1．了解微生物學(xué)實(shí)驗基本概念，認識微生物學(xué)實(shí)驗基本材料。
2．熟悉微生物實(shí)驗所需各種常用器皿的名稱(chēng)和規格。
3．學(xué)會(huì )正確的清洗玻璃器皿的方法和包扎方法，為實(shí)驗做準備。
4．熟讀與牢記微生物學(xué)實(shí)驗規則和安全。
二、實(shí)驗原理
為了保證實(shí)驗順利進(jìn)行，要求把實(shí)驗所用器皿清洗干凈，保持滅菌后無(wú)菌狀態(tài)，需要對培養皿、吸管等進(jìn)行妥善包扎，試管和三角瓶要做棉塞。清洗方法根據實(shí)驗目的、器皿的種類(lèi)、所盛放的物品、洗凈劑的類(lèi)別和沾污程度等的不同而有所不同，不同的器皿包扎方法也不同。
三、實(shí)驗器材
1．常用的各種玻璃器皿(三角瓶、移液管、試管、吸管、培養皿、玻片)。
2．洗滌工具和去污粉、肥皂、洗滌液。
3．接種工具、棉花、紗布、棉線(xiàn)等。
四、操作步驟(一)玻璃器皿的認識
1．試管：微生物實(shí)驗室所用的玻璃試管，根據其大小和用途不同，有下列三種型號：
(1)大試管(約18mm×180mm)：可裝倒平板用的培養基，也可作制備斜面用(需要大量菌體時(shí)用)和裝液體培養基用于微生物的振蕩培養。
(2)中試管[(13～15)mm×(100～150)mm]：裝液體培養基培養細菌或做斜面用，也可用于細菌、霉菌、病毒等的稀釋和血清學(xué)試驗。
(3)小試管[(10～12)mm×100mm]：一般用于糖發(fā)酵或血清學(xué)試驗，和其它需要節省材料的試驗。
2．德漢氏小管
觀(guān)察細菌在糖發(fā)酵培養基內是否產(chǎn)氣時(shí)，在小試管內倒置一小套管(約6mm×36mm)(圖1)，此小套管即德漢氏小管，又稱(chēng)發(fā)酵小倒管。
3．小塑料離心管
微生物學(xué)實(shí)驗篇二：微生物學(xué)實(shí)驗
實(shí)驗一、實(shí)驗室和人體表面微生物的檢查
一實(shí)驗目的
1證明實(shí)驗室環(huán)境與體表存在微生物
2比較來(lái)自不同場(chǎng)所與不同條件下細菌的數量和類(lèi)型
3體會(huì )無(wú)菌操作的重要性
二實(shí)驗原理
平板培養基含有細菌生長(cháng)所需要的營(yíng)養成分，當取自不同來(lái)源的樣品接種于培養基上，在適宜溫度下培養，1-2d內每一菌體能通過(guò)很多次細胞分裂而進(jìn)行繁殖，形成一個(gè)可見(jiàn)的細胞群體的集落，稱(chēng)為菌落。每一種細菌所形成的菌落都有它自己的特點(diǎn)，例如菌落的大小、表面干燥或濕潤、隆起或扁平、粗糙或光滑等。因此可通過(guò)平板培養基來(lái)檢查環(huán)境中微生物的數量和類(lèi)型。
三、器材
1、培養基牛肉膏蛋白胨瓊脂平板
2、儀器或其他用具無(wú)菌水、滅菌棉簽（裝在試管內），接種環(huán)，試管架，酒精燈，記號筆，廢物缸。
四、操作步驟
1、寫(xiě)標簽
任何一個(gè)實(shí)驗，在動(dòng)手操作前均需首先將器皿用記號筆做上記號（包括班級、姓名、日期、樣品來(lái)源等），字盡量小些，寫(xiě)在皿底的一邊，不要寫(xiě)在當中，以免影響觀(guān)察結果。
注：培養皿的記號一般寫(xiě)在皿底上，如果寫(xiě)在皿蓋上，同時(shí)觀(guān)察兩個(gè)以上培養皿的結果，打開(kāi)皿蓋時(shí)容易混淆。
2、實(shí)驗室細菌檢查
�。�1）空氣
將一個(gè)肉膏蛋白胨瓊脂平板放在實(shí)驗臺上，移去皿蓋，使瓊脂培養基表面暴露在空氣中，將另一塊肉膏蛋白胨瓊脂平板放在潔凈工作臺內或無(wú)人走動(dòng)的實(shí)驗室中，移去皿蓋，1h后蓋上兩個(gè)皿蓋。
�。�2）實(shí)驗臺
�、儆糜浱柟P在皿底外面中央畫(huà)一直線(xiàn)，再在此線(xiàn)中間處畫(huà)一垂直線(xiàn)。
�、谌∶藓�
左手拿含有棉簽的試管，在火焰旁用右手的手掌邊緣和小指、無(wú)名指夾持棉塞，將其取出，將管口很快地通過(guò)酒精燈的火焰，燒灼管口；輕輕地傾斜試管，用右手的拇指和食指將棉簽小心地取出。放回棉塞，并將空試管放在試管架上。
�、叟獫衩藓�
左手取滅菌水試管，如上法拔出棉塞并燒灼管口，將棉簽插入水中，再提出水面，在管壁上擠壓一下以除去過(guò)多的水分，小心將棉簽取出，燒灼管口，放回棉塞，并將滅菌水試管放在試管架上。
�、苋訉衩藓炘趯�(shí)驗臺面或門(mén)旋鈕上擦拭約2cm2的范圍。
�、萁臃N在火焰旁用左手拇指和食指或中指使平皿開(kāi)啟成一縫。再將棉簽伸入，在瓊脂表面頂端接種（滾動(dòng)一下），立即閉合皿蓋。將原放棉簽的空試管拔出棉塞，燒灼管口，插入用過(guò)的棉簽，將試管放回試管架。
�、迍澗�(xiàn)
另取接種環(huán)在火焰上滅菌，先將環(huán)端燒熱，然后將接種環(huán)提起垂直放在火焰上，以使火焰接觸金屬絲的范圍廣一些，待接種環(huán)燒紅，再將接種環(huán)斜放，沿環(huán)向上，燒至可能碰到培養皿的部分，再移向環(huán)端，如此很快地來(lái)回通過(guò)火焰數次。
左手拿起平板，同樣開(kāi)啟一縫，將滅過(guò)菌并冷卻了的接種環(huán)（可在瓊脂表面邊緣空白處試溫度，若發(fā)出濺潑聲，表示太燙），通過(guò)瓊脂頂端的接種區，向下劃線(xiàn)，直到平板的一半處。注意：接種環(huán)與瓊脂表面的角度要小，移動(dòng)的壓力不能太大，否則會(huì )刺破瓊脂。
閉合皿蓋，左手將平板向左轉動(dòng)至空白處，右手拿的接種環(huán)再在火焰上燒灼，使冷。接種環(huán)通過(guò)前面劃的線(xiàn)條再在瓊脂的另一半，從上向下來(lái)回劃線(xiàn)至1／2處。
燒灼接種環(huán)，轉動(dòng)平板，劃最后1／4，立刻蓋上皿蓋，燒灼接種環(huán)，放回原處。
整個(gè)劃線(xiàn)操作均要求無(wú)菌操作，即靠近火焰，而且動(dòng)作要快。
3、人體細菌的檢查
�。�1）手指（洗手前與洗手后）
�。�2）鼻腔按照實(shí)驗臺檢查法的步驟②，取出棉簽，并將其弄濕。用濕棉簽在鼻腔內滾動(dòng)數次，按實(shí)驗臺檢查法的步驟⑤和⑥接種與劃線(xiàn)，然后蓋上皿蓋。
4、將所有的瓊脂平板翻轉，使皿底朝上，放37℃培養箱，培養1-2d
5、結果記錄方法
�。�1）菌落計數在劃線(xiàn)的平板上，如果菌落很多而重疊，則數平板最后1/4面積內的菌落數，不是劃線(xiàn)的平板，也一分為四，數1/4面積的菌落數。
�。�2）根據菌落大小、形狀、高度、干濕等特征觀(guān)察不同的菌落類(lèi)型。
菌落特征：大小、顏色、干濕情況、形態(tài)、高度、透明程度、邊緣。
菌落特征描寫(xiě)方法如下：
�、俅笮〈�、中、小、針尖狀�？上葘⒄麄�(gè)平板上的菌落粗略觀(guān)察一下，再決定大、中、小的標準，或由教師指出一個(gè)大小范圍。
�、陬伾S色、金黃色、灰色、乳白色、紅色、粉紅色等。
�、鄹蓾袂闆r干燥、濕潤、粘稠。
�、苄螒B(tài)圓形、不規則等。（e）高度扁平、隆起、凹下。
�、萃该鞒潭韧该�、半透明、不透明。
�、捱吘壵R、不整齊。
五、實(shí)驗報告
P13：結果1、思考題3、4
1、比較各種來(lái)源的樣品，哪一種樣品的平板菌落數與菌落類(lèi)型最多？
2、人多的實(shí)驗室與無(wú)菌室（或無(wú)人走動(dòng)的實(shí)驗室）相比，平板上的菌落數與菌落類(lèi)型有什么區別？你能解釋一下造成這種區別的原因嗎？
3、通過(guò)本次實(shí)驗，在防止培養物的污染與防止細菌的擴散方面，你學(xué)到些什么？有什么體會(huì )？
六、實(shí)驗總結
實(shí)驗二、細菌簡(jiǎn)單染色和普通光學(xué)顯微油鏡的使用和細菌形態(tài)觀(guān)察
一、目的要求
1．學(xué)習微生物涂片、染色的基本技術(shù)，掌握細菌的單染色方法及無(wú)菌操作技術(shù)。
2．熟悉普通光學(xué)顯微鏡的構造及各部分的功能。
3．學(xué)習并掌握油鏡的原理和使用方法。
二、油鏡物鏡的基本原理
微生物學(xué)研究用的顯微鏡的物鏡通常有低倍物鏡（16mm，10×）、高倍物鏡（4mm，40～45×）和油鏡（1.8mm，95～100×）三種。油鏡通常標有黑圈或紅圈，也有的以“OI（oilimmer-sion）字樣表示，它是三者中放大倍數最大的。根據使用不同放大倍數的目鏡，可使被檢物體放大1000～2000多倍。油鏡的焦距和工作距離（標本在焦點(diǎn)上看得最清晰時(shí)，物鏡與樣品之間的距離）最短，光圈則開(kāi)得最大，因此，在使用油鏡觀(guān)察時(shí)，鏡頭離標本十分近，需特別小心。使用時(shí)，油鏡與其他物鏡的不同是載玻片與物鏡之間不是隔一層空氣，而是隔一層油質(zhì)，稱(chēng)為油浸系。這種油常選用香柏油，因香柏油的折射率n=1.52，與玻璃相同。當光線(xiàn)通過(guò)載玻片后，可直接通過(guò)香柏油進(jìn)入物鏡而不發(fā)生折射。如果玻片與物鏡之間的`介質(zhì)為空氣，則稱(chēng)為干燥系，當光線(xiàn)通過(guò)玻片后，受到折射發(fā)生散射現象，進(jìn)入物鏡的光線(xiàn)顯然減少，這樣就減低了視野的照明度。
利用油鏡不但能增加照明度，更主要的是能增加數值孔徑，因為顯微鏡的放大效能是由其數值孔徑?jīng)Q定的。所謂數值孔徑，即光線(xiàn)投射到物鏡上的最大角度（稱(chēng)為鏡口角）的一半正弦，乘上玻片與物鏡間介質(zhì)的折射率所得的乘積，可用下列公式表示：
NA＝n·sinα式中NA=數值孔徑；n=介質(zhì)折射率；α=最大入射角的半數，即鏡口角的半數。因此，光線(xiàn)投射到物鏡的角度愈大，顯微鏡的效能就愈大，該角度的大小決定于物鏡的直徑和焦距。
所謂單染色法是利用單一染料對細菌進(jìn)行染色的一種方法。此法操作簡(jiǎn)便，適用于菌體一般形態(tài)的觀(guān)察。在中性、堿性或弱酸性溶液中，細菌細胞通常帶負電荷，所以常用堿性染料進(jìn)行染色。堿性染料并不是堿，和其他染料一樣是一種鹽，電離時(shí)染料離子帶正電，易與帶負電荷的細菌結合而使細菌著(zhù)色。例如，美藍（亞甲藍）實(shí)際上是氯化亞甲藍鹽（methylenebluechloride，縮寫(xiě)為MBC），它可被電離成正、負離子：MBC→methyleneblue++chloride-帶正電荷的染料離子可使細菌細胞染成藍色。常用的堿性染料除美藍外，還有結晶紫（crystalviolet）、堿性復紅（basicfu-chsin）、番紅（又稱(chēng)沙黃，safranine）等。細菌體積小，較透明，如未經(jīng)染色常不易識別，而經(jīng)著(zhù)色后，與背景形成鮮明的對比，使易于在顯微鏡下進(jìn)行觀(guān)察。
三、器材顯微鏡，酒精燈，載玻片，接種環(huán)，香柏油，二甲苯，擦鏡紙，生理鹽水；結晶紫染色液，堿性復紅染色液；金黃色葡萄球菌，大腸桿菌。
四、操作步驟
1、涂片
取兩塊干凈的載玻片，各滴一小滴生理鹽水于載玻片中央，用無(wú)菌操作（參照實(shí)驗一），分別挑取金黃色葡萄球菌和大腸桿菌于二載玻片的水滴中（每一種菌制一片），調勻并涂成薄膜。注意滴生理鹽水時(shí)不宜過(guò)多，涂片必須均勻。
2、干燥于室溫中自然干燥。
3、固定涂片面向上，于火焰上通過(guò)2—3次，使細胞質(zhì)凝固，以固定細菌的形態(tài)，并使其不易脫落。但不能在火焰上烤，否則細菌形態(tài)將毀壞。
4、染色放標本于水平位置，分別滴加染色液于涂片薄膜上，染色時(shí)間長(cháng)短隨不同染色液而定。結晶紫染色液染2—3分鐘，石炭酸復紅染色液約染1—2分鐘。
5、水洗
染色時(shí)間到后，用自來(lái)水沖洗，直至沖下之水無(wú)色時(shí)為止。注意沖洗水流不宜過(guò)急，過(guò)大，水由玻片上端流下，避免直接沖在涂片處。沖洗后，將標本晾干或用吹風(fēng)機吹干，待完全干燥后才可置油鏡下觀(guān)察。
6、鏡檢
�。�1）、低倍鏡觀(guān)察
�。�2）、高倍鏡觀(guān)察
�。�3）、油鏡觀(guān)察
�、儆么终{節器將鏡筒提起約2cm，將油鏡轉至正下方。
�、谠诓Ｆ瑯吮镜溺R檢部位滴上一滴香柏油。
�、蹚膫让孀⒁�，用粗調節器將鏡筒小心地降下，使油鏡浸在香柏油中，其鏡頭幾乎與標本相接，應特別注意不能壓在標本上，更不可用力過(guò)猛，否則不僅壓碎玻片，也會(huì )損壞鏡頭。④從接目鏡內觀(guān)察，進(jìn)一步調節光線(xiàn)，使光線(xiàn)明亮，再用粗調節器將鏡筒徐徐上升，直至視野出現物像為止，然后用細調節器校正焦距。如油鏡已離開(kāi)油面而仍未見(jiàn)物像，必須再從側面觀(guān)察，將油鏡降下，重復操作至物像看清為止。
用同樣的方法觀(guān)察枯草芽孢桿菌染色標本。
�、萦^(guān)察完畢，上旋鏡筒。先用擦鏡紙拭去鏡頭上的油，然后用擦鏡紙蘸少許二甲苯（香柏油溶于二甲苯）擦去鏡頭上殘留油跡，最后再用干凈擦鏡紙擦去殘留的二甲苯。切忌用手或其他紙擦鏡頭，以免損壞鏡頭。用綢布擦凈顯微鏡的金屬部件。
�、迣⒏鞑糠诌�原，反光鏡垂直于鏡座，將接物鏡轉成八字形，再向下旋。同時(shí)把聚光鏡降下，以免接物鏡與聚光鏡發(fā)生碰撞危險。
五、實(shí)驗報告
1．結果：繪出你所觀(guān)察到的經(jīng)單染色的兩種細菌形態(tài)圖。（注明物鏡放大倍數和總放大率）
2．思考題
P18思考題1、P28思考題2、3
�。�1）根據實(shí)驗體會(huì )，你認為制備染色標本時(shí)，應注意哪些事項？
�。�2）制片為什么要完全干燥后才能用油鏡觀(guān)察？
�。�3）在明視野顯微鏡下，觀(guān)察細菌形態(tài)時(shí)，你認為用染色標本好，還是用未染色的活標本好，為什么？
使用油鏡按下列步驟操作：
1、先用粗調節旋鈕將鏡筒提升（或將載物臺下降）約2cm，并將高倍鏡轉出。
2、在玻片標本的鏡檢部位滴上一滴香柏油。
3、從側面注視，用粗調節旋鈕將載物臺緩緩地上升，（或鏡筒下降），使油浸物鏡浸入香柏油中，使鏡頭幾乎與標本接觸。
4、從接目鏡內觀(guān)察，放大視場(chǎng)光闌及聚光鏡上的虹彩光圈（帶視場(chǎng)光闌油鏡開(kāi)大視場(chǎng)光闌），上調聚光器，使光線(xiàn)充分照明。用粗調節旋鈕將載物臺徐徐下降（或鏡筒上升），當出現物像一閃后改用細調節旋鈕調至最清晰為止。如油鏡已離開(kāi)油面而仍未見(jiàn)到物象，必須再從側面觀(guān)察，重復上述操作。
5、觀(guān)察完畢，下降載物臺，將油鏡頭轉出，先用擦鏡紙擦去鏡頭上的油，再用擦鏡紙蘸少許乙醚酒精混合液（乙醚2份，純酒精3份）或二甲苯，擦去鏡頭上殘留油跡，最后再用擦鏡紙擦拭2—3下即可，（注意向一個(gè)方向擦拭）。
6、將各部分還原，轉動(dòng)物鏡轉換器，使物鏡頭不與載物臺通光孔相對，而是成八字形位置，再將鏡筒下降至最低，降下聚光器，反光鏡與聚光器垂直，用一個(gè)干凈手帕將接目鏡罩好，以免目鏡頭沾污灰塵。最后用柔軟紗布清潔載物臺等機械部分，然后將顯微鏡放回柜內或鏡箱中。
六、實(shí)驗總結
實(shí)驗三、細菌的革蘭氏染色
一、目的要求
了解革蘭氏染色的原理，學(xué)習并掌握革蘭氏染色的方法。
二、基本原理
革蘭氏染色反應是細菌分類(lèi)和鑒定的重要性狀。它是1884年由丹麥醫師Gram創(chuàng )立的。革蘭氏染色法（Gramstain）不僅能觀(guān)察到細菌的形態(tài)而且還可將所有細菌區分為兩大類(lèi)：染色反應呈藍紫色的稱(chēng)為革蘭氏陽(yáng)性細菌，用G+表示；染色反應呈紅色（復染顏色）的稱(chēng)為革蘭氏陰性細菌，用G-表示。
三、器材
大腸桿菌，金黃色葡萄球菌；草酸銨結晶紫，番水水溶液，碘液，95%乙醇，載玻片，顯微鏡等。
四、操作步驟
1．涂片將培養24小時(shí)的金黃色葡萄球菌和大腸桿菌分別作涂片（注意涂片切不可過(guò)于濃厚），干燥、固定。固定時(shí)通過(guò)火焰1～2次即可，不可過(guò)熱，以載玻片不燙手為宜。
2．染色
�。�1）初染加草酸銨結晶紫一滴，約一分鐘，水洗。
�。�2）媒染滴加碘液沖去殘水，并覆蓋約一分鐘，水洗。
�。�3）脫色將載玻片上面的水甩凈，并襯以白背景，用95％酒精滴洗至流出酒精剛剛不出現紫色時(shí)為止，約20～30秒鐘，立即用水沖凈酒精。
�。�4）復染用番紅液染1～2分鐘，水洗。
�。�5）鏡檢干燥后，置油鏡觀(guān)察。革蘭氏陰性菌呈紅色，革蘭氏陽(yáng)性菌呈紫色。以分散開(kāi)的細菌的革蘭氏染色反應為準，過(guò)于密集的細菌，常常呈假陽(yáng)性。
�。�6）同法在一載玻片上以大腸桿菌與金黃色葡萄球菌混合制片，作革蘭氏染色對比。
革蘭氏染色的關(guān)鍵在于嚴格掌握酒精脫色程度，如脫色過(guò)度，則陽(yáng)性菌可被誤染為陰性菌；而脫色不夠時(shí)，陰性菌可被誤染為陽(yáng)性菌。此外，菌齡也影響染色結果，如陽(yáng)性菌培養時(shí)間過(guò)長(cháng)，或已死亡及部分菌自行溶解了，都常呈陰性反應。
五、實(shí)驗報告
1．結果
在你所作的革蘭氏染色制片中，大腸桿菌和金黃色葡萄球菌各染成何色？它們是革蘭氏陰性菌還是革蘭氏陽(yáng)性菌
2．思考題
P30思考題1、2、4
�。�1）作革蘭氏染色涂片為什么不能過(guò)于濃厚？其染色成敗的關(guān)鍵一步是什么？
�。�2）當你對一株未知菌進(jìn)行革蘭氏染色時(shí)，怎樣能確證你的染色技術(shù)操作正確，結果可靠？
六、實(shí)驗總結
20**級制藥專(zhuān)業(yè)工業(yè)微生物學(xué)實(shí)驗報告
姓名:劉甜甜學(xué)號:20**304090
班級:制藥**-2班指導老師：王健
日期：20**.6.11
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