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高二生物《大腸桿菌的培養和分離》的教案
一、大腸桿菌
1．大腸桿菌屬于革蘭氏________性菌，為_(kāi)_______型的腸道桿菌。
2．結構：屬于________生物。
3．用途：是在________技術(shù)中被廣泛采用的工具。
4．與人類(lèi)的關(guān)系：它生活在人類(lèi)的________中，一般對人________(“有”還是“無(wú)”)害。有一些菌株對人體能產(chǎn)生危害，因為它們可以侵蝕________并產(chǎn)生________。任何大腸桿菌如果進(jìn)入人的________系統，都會(huì )對人體產(chǎn)生危害。
答案：
1.陰 兼性厭氧
2．原核
3．基因工程
4．腸道 無(wú) 腸黏膜 毒素 泌尿
二、細菌的培養和分離
1．細菌的培養：
(1)細菌的繁殖：細菌以________的方式繁殖，分裂速度很快，約________分裂一次。
(2)培養細菌的方法：培養細菌，需要將________________________________________________________________________
轉移到________中，一般用________來(lái)轉移帶菌的培養物。
(3)用不同培養基培養細菌的差別：
接種后，培養細菌的培養基類(lèi)型 接種方法 接種后培養的時(shí)間(單位：小時(shí)) 培養結果
液體培養基 接種環(huán)直接接種 培養8 h后 每毫升培養基中有________個(gè)細菌
固體培養基 用接種環(huán)在培養基上用________________________________________________________________________的方式接種(該法還可以用于______) 培養10～20 h后 一個(gè)細菌細胞會(huì )繁殖成許多個(gè)細菌細胞，這些細胞________________________________________________________________________________，形成____________________________________________________________
2.細菌的分離：
(1)分離的方法與特點(diǎn)：分離細菌有________和________2種。前者方法簡(jiǎn)單，后者操作復雜，但是______________________________________________________________更易分開(kāi)。
(2)本實(shí)驗進(jìn)行大腸桿菌分離，是用________法，就是在________培養基上進(jìn)行細菌的________。
答案：1.
(1)分裂 20 min
(2)已有細菌的培養物 新的培養基 接種環(huán)
(3)幾億 劃線(xiàn) 分離細菌 緊緊聚集在一起菌落
2.(1)劃線(xiàn)分離法 涂布分離法 單菌落
(2)劃線(xiàn)分離固體平面劃線(xiàn)培養
三、滅菌操作
1．滅菌操作的原因：為了獲得________的培養物，其關(guān)鍵是防止外來(lái)________的入侵污染。因此，在培養微生物時(shí)必須進(jìn)行________操作。
2．無(wú)菌操作的條件：
(1)首要條件是________必須是無(wú)菌的；
(2)________必須是無(wú)菌的；
(3)________的過(guò)程必須是無(wú)菌的等。
答案：1.純凈 雜菌 無(wú)菌
2．(1)各種器皿 (2)各種培養基 (3)菌轉移操作
四、大腸桿菌的培養和分離實(shí)驗
1．實(shí)驗目的：
(1)進(jìn)行大腸桿菌的________，利用________培養基進(jìn)行細菌培養的操作；
(2)進(jìn)行大腸桿菌的________，用________培養基進(jìn)行細菌的________培養；
(3)說(shuō)明大腸桿菌培養的條件和操作要求的原理。
2．實(shí)驗步驟
(1)滅菌：用________在________壓力下對LB液體培養基、LB固體培養基和培養皿進(jìn)行滅菌________min。
(2)自________向________中轉移并分裝固體培養基：
待冷卻至______左右，將三角錐形瓶中的______培養基，在______上分裝至幾個(gè)______中，制成______培養基。
(3)將大腸桿菌自________轉移到________中的________培養基中培養：
將大腸桿菌用________在無(wú)菌操作下接種至三角錐形瓶中的________培養基中，在________搖床振蕩培養________，完成大腸桿菌的培養。
(4)將菌液在________培養基上進(jìn)行________分離：
從前一步培養得到的菌液中獲取菌種，用________以__________法接種至第二步所制得的__________培養基中，在________℃恒溫箱中培養________h后觀(guān)察菌落。
(5)菌種保存：
在無(wú)菌操作下將________用________取出，再用________法接種在________上，________培養________后，________冰箱保存。
3．分離實(shí)驗的結果及相應結論：
觀(guān)察中若看到在________的末端出現________，則表明菌已被分離了。
4．大腸桿菌分離的用途：________的通用方法，也是用于________的最簡(jiǎn)便方法之一。
答案：1.(1)擴增 液體 (2)分離 固體平面 劃線(xiàn)
2．(1)高壓鍋 1 kg 15 (2)三角瓶 培養皿 60 ℃
固體 超凈臺 培養皿 固體平面 (3)斜面 三角瓶 液體
接種環(huán) 液體 37 ℃ 12 h (4)固體平面 劃線(xiàn) 接種環(huán)
劃線(xiàn) 固體平面 37 12～24 (5)單菌落 接種環(huán) 劃線(xiàn) 斜面 37 ℃ 24 h 4 ℃
3．劃線(xiàn) 不連續的單個(gè)菌落
4．消除污染雜菌 篩選高表達量菌株
核心解讀
1．微生物、細菌與大腸桿菌之間有怎樣的關(guān)系？
(1)概念內涵：其關(guān)系圖解見(jiàn)下
(2)結構上：三者都是結構簡(jiǎn)單，形體微小的生物，但是從細胞角度看其結構是不同的，具體如下：
2．培養大腸桿菌的LB培養基中有各種物質(zhì)，為什么選擇這些物質(zhì)，這些物質(zhì)有什么作用呢？
(1)人們按照微生物對營(yíng)養物質(zhì)的不同需求，配制出了供其生長(cháng)繁殖的營(yíng)養基質(zhì)——培養基。雖然各種培養基的具體配方不同，但一般都含有五大營(yíng)養要素，即水、無(wú)機鹽、碳源(提供碳元素)、氮源(提供氮元素)和生長(cháng)因子(不同的細菌需要的各不相同，有物種差異，它主要補充自身不能合成的或合成能力較弱的，但卻是生長(cháng)繁殖必需的物質(zhì))。見(jiàn)下表：
微生物的營(yíng)養要素 定義 功能 類(lèi)型 化合物類(lèi)型 常用物質(zhì)
碳源 凡可構成微生物細胞和代謝產(chǎn)物中碳架來(lái)源的營(yíng)養物質(zhì)稱(chēng)為碳源 構成細胞物質(zhì)，供給微生物生長(cháng)發(fā)育所需要的能量 無(wú)機碳(自養型微生物用) 無(wú)機物 CO2、NaHCO3、CaCO3等
有機碳(異養型微生物用) 蛋白質(zhì)、核酸類(lèi) 牛肉膏、蛋白胨、花生粉餅、明膠、氨基酸等
糖類(lèi)脂質(zhì)等 葡萄糖、蔗糖、淀粉等
氮源 凡是構成微生物的細胞物質(zhì)或代謝產(chǎn)物中氮素來(lái)源的營(yíng)養物質(zhì)稱(chēng)為氮源 主要是提供合成原生質(zhì)和細胞其他結構的原料，一般不作能源 無(wú)機氮 銨鹽 NH3、(NH4)2SO4
硝酸鹽 KNO3
N2 空氣
有機氮 牛肉膏、蛋白胨、醇母膏、尿素、明膠等
生長(cháng)因子 一類(lèi)對微生物正常代謝必不可少且又不能從簡(jiǎn)單的碳、氮源自行合成的所需極微量的有機物 一般是酶和核酸的組成成分 酵母膏、玉米漿、黃豆餅粉、動(dòng)植物組織液、麥芽汁等，復合維生素
水 作用：組成成分；反應介質(zhì)；物質(zhì)運輸媒體；熱的良導體
無(wú)機鹽 作用：維持滲透壓、pH等
(2)大腸桿菌的LB培養基
微生物的營(yíng)養要素 本實(shí)驗中大腸桿菌LB培養基配方 培養基配方與微生物營(yíng)養要素的對應關(guān)系
LB液體培養基 LB固體培養基
氮源、
碳源、
無(wú)機鹽、
生長(cháng)因子、
水
瓊脂1 g
蛋白胨0.5 g 主要提供大腸桿菌的氮源、碳源需求
酵母提取物0.25 g 主要提供生長(cháng)因子
NaCl 0.5 g 提供無(wú)機鹽
水 50 mL 提供水
(3)此外配方中還要注意pH等。
3．該實(shí)驗中這些操作的原因
(1)三角錐形瓶中的LB固體培養基滅菌后，需要冷卻到60 ℃左右時(shí)，才用來(lái)轉移和分裝，制成固體平面培養基，為什么？你用什么簡(jiǎn)易方法快速估計該溫度？
因為三角錐形瓶中的LB固體培養基中有瓊脂，它在98 ℃以上熔化，在44 ℃以下凝固，當冷卻到60 ℃左右時(shí)，不會(huì )因溫度過(guò)高燙手而不易操作；也不會(huì )因為溫度過(guò)低而使三角錐形瓶中的培養基凝固，最終無(wú)法轉移分裝制成新的平面培養基。
簡(jiǎn)易估計溫度的方法：可以用手觸摸滅菌后的三角錐形瓶，感覺(jué)錐形瓶由燙手轉為剛剛不燙手時(shí)，則說(shuō)明已經(jīng)冷卻到60 ℃左右了。
(2)進(jìn)行恒溫培養時(shí)，為什么要將培養皿倒置？
恒溫培養時(shí)，培養基中的水分會(huì )以水蒸氣的形式蒸發(fā)，倒放培養皿則會(huì )使水蒸氣凝結成水滴留在蓋子上；如果正放培養皿，則水分形成的水滴會(huì )落入培養基表面并且擴散開(kāi)。如果培養皿中已形成菌落，則菌落中的菌會(huì )隨水擴散，菌落間相互影響，很難再分成單菌落，達不到分離的目的，培養皿中的菌落還有可能被蓋子上掉落的水給污染。
(3)將大腸桿菌用接種環(huán)自斜面轉移到液體培養基中培養時(shí)，為什么接種環(huán)必須先深入到斜面冷卻后，才能再取斜面上的菌體？
接種環(huán)在取菌體前曾在酒精燈火焰上灼燒滅菌，一直灼燒至紅，溫度很高，若不冷卻就直接用其取斜面上的菌體，菌體可能因為接觸高溫接種環(huán)而死亡，導致大腸桿菌的轉移培養失敗。
(4)用劃線(xiàn)法分離大腸桿菌中，第一次和隨后的幾次劃線(xiàn)前都要灼燒接種環(huán)，它們的原因一樣嗎？在劃線(xiàn)結束后仍然要灼燒接種環(huán)這又是為什么呢？
雖然每次灼燒都是為了滅菌，但所滅的菌種和原因卻不一樣。
灼燒接種環(huán)的時(shí)間 消滅的菌體 原因
第一次劃線(xiàn)前 其他雜菌 防止其他雜菌的侵入而造成污染
隨后的幾次劃線(xiàn)前 上次劃線(xiàn)結束后殘留在接種環(huán)上的實(shí)驗菌(本實(shí)驗為：大腸桿菌) 為了使下一次劃線(xiàn)時(shí)，接種環(huán)上的菌來(lái)自上次劃線(xiàn)的末端，從而通過(guò)劃線(xiàn)次數的增加，使每次劃線(xiàn)時(shí)菌種的數目逐漸減少，最終獲得單個(gè)菌落，實(shí)現菌的分離
最后一次劃線(xiàn)結束后 為了防止實(shí)驗菌殘留于接種環(huán)而污染環(huán)境和感染實(shí)驗人員
(5)用劃線(xiàn)法分離大腸桿菌時(shí)，每次的劃線(xiàn)是怎么樣的？對隨后的劃線(xiàn)的起點(diǎn)有什么要求？為什么這樣要求呢？
每一次的劃線(xiàn) 依次的2次劃線(xiàn)之間的關(guān)系 各次劃線(xiàn)的分布
圖形輔助理解
劃線(xiàn)的要求 不能出現線(xiàn)條的重疊 第二次以及隨后的劃線(xiàn)操作，總是從上一次劃線(xiàn)的末端開(kāi)始 不要將最后一區的劃線(xiàn)與第一區相連
這樣要求的原因 使線(xiàn)條末端細菌的數目比線(xiàn)條起始處要少 因為劃線(xiàn)后，線(xiàn)條末端細菌的數目比線(xiàn)條起始處要少，每次從上一次劃線(xiàn)的末端開(kāi)始，能使細菌的數目隨著(zhù)劃線(xiàn)次數的增加而逐漸減少，最終得到有單個(gè)細菌繁殖而來(lái)的單菌落 若相連，則可能最后一次劃線(xiàn)末端處的細菌與第一次的疊加，細菌的數目不是最少的，不能使細菌的數目隨著(zhù)劃線(xiàn)次數的增加而逐漸減少，最終將很難獲得單菌落
4．消毒與滅菌一樣嗎？
概念 常用方法 應用的范圍
消毒 使用較為溫和的物理或化學(xué)方法僅殺死物體表面或內部一部分對人體有害的微生物(不包括芽孢和孢子) 煮沸消毒法：在100 ℃煮沸5～6 min 一般物品
巴氏消毒法：70～75 ℃煮30 min或在80 ℃煮15 min 對于一些不耐高溫的液體，如牛奶
化學(xué)藥劑消毒法 如用酒精擦拭雙手、用氯氣消毒水源等
滅菌 使用強烈的理化因素殺死物體內外所有的微生物(包括芽孢和孢子) 灼燒滅菌：酒精燈火焰 接種工具的滅菌
干熱滅菌：160～170 ℃下滅菌1～2 h 玻璃器皿、金屬工具的滅菌
高壓蒸汽滅菌：121 ℃條件下，滅菌15～30 min 培養基及容器的滅菌
5.本實(shí)驗中還需要了解哪些基礎知識才更便于掌握和理解呢？
(1)牛肉膏蛋白胨的知識
牛肉膏和蛋白胨來(lái)源于動(dòng)物原料，含有糖、維生素和有機氮等營(yíng)養物質(zhì)。
1 000 mL牛肉膏蛋白胨培養基的營(yíng)養構成
培養基組分 提供的主要營(yíng)養
牛肉膏 5 g 碳源、磷酸鹽和維生素
蛋白胨 10 g 氮源和維生素
NaCl 5 g 無(wú)機鹽
H2O 定容至1 000 mL 氫元素、氧元素
(2)巴氏消毒法的知識
巴氏消毒法也稱(chēng)做低溫消毒法。
日常生活中經(jīng)常用到煮沸消毒法。在100 ℃煮沸 5～6 min 可以殺死微生物的營(yíng)養細胞和一部分芽孢。對于一些不耐高溫的液體，如牛奶，則使用巴氏消毒法，在70～75 ℃煮30 min或在80 ℃煮15 min，可以殺死牛奶中的微生物，并且使牛奶的營(yíng)養成分不被破壞。
題例領(lǐng)悟TILILINGWU
【例題1】 下列操作屬于滅菌的是( )
A．用酒精擦拭實(shí)驗人員的雙手
B．用氯氣處理水源
C．將接種環(huán)在酒精燈火焰上灼燒至紅
D．殺死物體表面或內部一部分對人體有害的微生物
解析：此題考查對微生物實(shí)驗中滅菌的理解。對微生物培養來(lái)說(shuō)，滅菌操作十分重要，其目的就是為了獲得純凈的培養物，其關(guān)鍵是防止外來(lái)一切雜菌的入侵，不僅僅是對人體有害的微生物。滅菌操作一般使用強烈的物化因素(如：灼燒滅菌、高壓蒸汽滅菌等)。而不是使用較為溫和的物化方法。
答案：C
消毒與滅菌是不同的。兩者除了在物化手段上是否強烈外，所消滅的微生物內容也是不同的。滅菌是消除一切雜菌，而消毒僅僅殺死對人體有害的微生物。消毒往往無(wú)法消滅微生物的芽孢和孢子。
【例題2】 下列關(guān)于平板劃線(xiàn)的操作及敘述，正確的是 …
( )
A．灼燒接種環(huán)之后，為避免其他雜菌的干擾，應立即伸入菌液取菌種
B．劃線(xiàn)結束后，為避免實(shí)驗菌污染環(huán)境和感染操作者，所以必須再次灼燒接種環(huán)
C．在第一次劃線(xiàn)前灼燒接種環(huán)和每次劃線(xiàn)前灼燒接種環(huán)的目的相同
D．劃線(xiàn)時(shí)最后一區域一定要與第一區域相連，達到首尾相接
解析：此題考查對劃線(xiàn)法分離大腸桿菌的掌握。這是本實(shí)驗的一大重點(diǎn)和難點(diǎn)。A的操作是錯誤的，灼燒接種環(huán)之后，要冷卻后方能取菌種，以免溫度太高殺死菌種。B的操作完全正確。C的敘述是錯誤的，它們的灼燒目的完全不同，第一次劃線(xiàn)前的灼燒是為了殺死其他雜菌，保證實(shí)驗菌的純凈，而隨后的灼燒卻是為了殺死殘留于接種環(huán)上的實(shí)驗菌，保證實(shí)驗菌隨劃線(xiàn)次數的增加而減少，每次劃線(xiàn)的菌種來(lái)自上一次劃線(xiàn)的末端。D的操作也是不正確的，不應該相連，這樣才能使最后一次劃線(xiàn)不受第一次劃線(xiàn)的干擾。
答案：B
大腸桿菌的分離所采用的就是劃線(xiàn)分離法。這一方法十分重要。我們不僅要知其每一步具體的操作，還要知其所以然，還要關(guān)注注意事項，避免踏入誤區。
隨堂訓練SUITANGXUNLIAN
1細菌培養過(guò)程中分別采用了高壓蒸汽、酒精、火焰灼燒等幾種不同的處理，這些方法依次用于殺滅哪些部位的雜菌( )
A．接種針、手、培養基 B．高壓鍋、手、接種針
C．培養基、手、接種針 D．接種針、手、高壓鍋
答案：C 解析：滅菌是微生物培養過(guò)程中的重要環(huán)節。其中高壓蒸汽是為了殺滅培養基中的雜菌；酒精擦拭雙手，是滅手上的雜菌；而接種針在火焰上灼燒，就是為了滅接種針上的菌。故C選項是正確的。
2下列關(guān)于倒平板的操作姿勢的敘述中，正確的是( )
A．右手無(wú)名指及小指夾持含有固體培養基的三角瓶封口膜
B．右手大拇指、食指拿著(zhù)三角瓶
C．左手拿著(zhù)培養皿，蓋子放于桌子上
D．倒平板時(shí)，為防止溫度過(guò)高，暫時(shí)熄滅酒精燈
答案：A 解析：倒平板技術(shù)是微生物技術(shù)中的基本技術(shù)。只有A是正確的。B中手指姿勢錯誤。C錯在培養皿蓋放在桌上了。D中熄滅酒精燈不對，整個(gè)過(guò)程都需在酒精燈火焰旁完成。
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