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生物樣品的熒光觀(guān)察
一、實(shí)驗目的
1、初掌握熒光顯微鏡和激光共聚焦掃描顯微鏡的結構、原理、使用方法及其在細胞生物學(xué)研究中的應用。
2、掌握生物材料的熒光染色和活體熒光蛋白的觀(guān)察方法。
3、了解激光共聚焦的原理。
二、實(shí)驗原理
1、某些物質(zhì)經(jīng)短波光照射后，分子被激活，吸收能量后呈激發(fā)態(tài)。其能量除部分轉換為熱量外，相當一部分則以波長(cháng)較長(cháng)的光能輻射出來(lái)，這種波長(cháng)長(cháng)于激發(fā)光的可見(jiàn)光稱(chēng)為熒光。細胞內的某些物質(zhì)經(jīng)過(guò)短波光照射后，可以發(fā)出自發(fā)熒光。在生物學(xué)研究中，能將發(fā)熒光的有機化合物-熒光染料與特定的細胞組分相結合，通過(guò)激發(fā)后產(chǎn)生的熒光對細胞組分進(jìn)行定性和定位。
2、生物樣品的熒光觀(guān)察采用熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡。熒光顯微鏡以波長(cháng)較短的光為光源，照射被檢樣品，激發(fā)被檢物品內的熒光物質(zhì)發(fā)出可見(jiàn)的熒光，通過(guò)物鏡和目鏡放大成像。激光共聚焦顯微鏡也是來(lái)觀(guān)察樣品中熒光分布狀況的。激光共聚焦顯微鏡是以激光為光源，在某一瞬間只用很小一部分光照明，通過(guò)檢測器的一個(gè)小孔或裂縫后成像，保證只有來(lái)自該焦平面的光成像，而來(lái)自焦平面外的散光則被小孔和裂縫擋住，成像異常清晰。此外，激光共聚焦顯微鏡可以在同一樣品的不同焦平面進(jìn)行掃描得到不同焦平面的圖像，然后通過(guò)計算機重構出樣品的三維結構。
3、本實(shí)驗中微絲的熒光觀(guān)察采用熒光素標記的鬼筆環(huán)肽（phalloidin），鬼筆環(huán)肽可以專(zhuān)一的結合在聚合狀態(tài)的肌動(dòng)蛋白絲上，起到穩定微絲的作用。細胞核的觀(guān)察用DAPI（diamidino-2-phenylindole）染色。DAPI能與DNA雙螺旋的凹槽部分相互作用，從而與DNA雙鏈緊密結合。結合后產(chǎn)生的熒光基團的吸收峰358nm，而散射峰是461nm。而植物細胞的花粉管、篩板和胞間連絲含有胼胝質(zhì)成分，經(jīng)苯胺藍染色后，用紫外光激發(fā)，可以發(fā)出黃綠色熒光。
4、激光共聚焦掃描顯微鏡（laserscanningconfocalmicroscope，LSCM）原理：用激光作掃描光源，逐點(diǎn)、逐行、逐面快速掃描成像，掃描的激光與熒光收集共用一個(gè)物鏡，物鏡的焦點(diǎn)即掃描(轉載于:www.hnNscy.CoM:生物熒光)激光的聚焦點(diǎn)，也是瞬時(shí)成像的物點(diǎn)。由于激光束的波長(cháng)較短，光束很細，所以共焦激光掃描顯微鏡有較高的分辨力，大約是普通光學(xué)顯微鏡的3倍。系統經(jīng)一次調焦，掃描限制在樣品的一個(gè)平面內。調焦深度不一樣時(shí)，就可以獲得樣品不同深度層次的圖像，這些圖像信息都儲于計算機內，通過(guò)計算機分析和模擬，就能顯示細胞樣品的立體結構。
三、實(shí)驗材料、試劑和儀器
1、材料：煙草懸浮細胞、擬南芥、蠶豆
2、試劑：3.6%多聚甲醛、Pipes緩沖液、100nmAlexaFluo488phalloidin、DAPI染色液、0.1%苯胺藍
3、儀器：Olympus熒光顯微鏡、恒溫培養箱、移液器、載玻片、蓋玻片、鑷子
四、實(shí)驗內容
（一）熒光標記觀(guān)察煙草懸浮細胞微絲骨架的分布
1、煙草懸浮細胞繼代培養。
MS培養基的基本成分：
MS無(wú)機鹽+KH2PO4200mg/L；煙酸10mg/L；維生素B11mg/L；
肌醇100mg/L；2，4-D0.1mg/L；蔗糖30g/L
在室溫、黑暗生長(cháng)，120~130rpm
2、固定：取300μl細胞液放入離心管中，靜置沉降，3000rpm離心30s，吸出培養基，加入500μl3.6%多聚甲醛，固定20min。再吸出固定液，用Pipes緩沖液清洗三次，每次5min。
3、染色：3000rpm離心1min，吸凈緩沖液，加入100nmAlexaFluo488phalloidin50μl，37℃染色20min，洗去染色液，加入50μl緩沖液，吸取10μl直接進(jìn)行封片。
4、熒光顯微鏡觀(guān)察：在藍光激發(fā)下進(jìn)行觀(guān)察，檢測的發(fā)射光波長(cháng)為510-530nm。
（二）DAPI染色檢測細胞核DNA
用鑷子夾住三朵不同發(fā)育時(shí)期的擬南芥的花，將花粉黏在載玻片上，加入20ulDAPI染色液染色3-5min。在紫外激發(fā)下用熒光顯微鏡觀(guān)察，檢測發(fā)射光為461nm。
（三）、苯胺藍染色觀(guān)察胞間連絲
撕取蠶豆葉片下表皮，用20μl0.1%苯胺藍染色3-5min后紫外激發(fā)下鏡檢。
五、實(shí)驗結果
（一）熒光標記觀(guān)察煙草懸浮細胞微絲骨架的分布
圖1煙草懸浮細胞微絲骨架形態(tài)（phalloidin標記，Olympus熒光顯微鏡，40×物鏡）
熒光顯微鏡下可以觀(guān)察到，煙草懸浮細胞呈現出不規則形狀，原因是培養之前去除了細胞壁。再培養一段時(shí)間后細胞壁再生，會(huì )有不同的形態(tài)。細胞中有一條綠色的絲狀結構，即為微絲，細胞和附近顏色較深。微絲在細胞內呈現三維空間分布，細胞核附近分布較多，經(jīng)查閱相關(guān)文獻，解釋為微絲在細胞內起到固定位置的作用。
（二）DAPI染色檢測細胞核DNA
圖2擬南芥花粉粒（DAPI染色，Olympus熒光顯微鏡，40×物鏡）
A三細胞型花粉粒B兩細胞型花粉粒
擬南芥的花粉粒呈微藍色的透明狀，細胞核被染成藍綠色。一個(gè)細胞內可以觀(guān)察到最多3個(gè)細胞核。
（三）、苯胺藍染色觀(guān)察胞間連絲
圖3蠶豆葉下表皮細胞胞間連絲（苯胺藍染色，Olympus熒光顯微鏡，40×物鏡）
A胞間連絲B熒光標記淬滅后的觀(guān)察效果
在紫外光激發(fā)的熒光顯微鏡下觀(guān)察，發(fā)現胞間連絲位于相鄰細胞之間的細胞壁上，呈現出綠色熒光。
六、分析與討論
1、在熒光標記觀(guān)察煙草懸浮細胞微絲骨架的分布實(shí)驗中，在藍光激發(fā)下，清晰的看到了發(fā)出綠色熒光的細胞骨架。同時(shí)，觀(guān)察到制片的背景較明亮，原因可能是phalloidin
染色后清洗不夠充分，導致殘留的phalloidin粘在載玻片上，發(fā)出熒光。同時(shí)本次實(shí)驗中在最后取樣階段細胞堆疊太多，導致微管組織顯色重疊，觀(guān)察不便。
2、在DAPI染色檢測擬南芥花粉的實(shí)驗中，看到部分花粉粒中都有三個(gè)明亮的發(fā)光點(diǎn)，判斷為三個(gè)細胞核。此外，還看到一些僅有兩個(gè)細胞核的花粉粒。我們知道成熟的擬南芥花粉為三細胞型。而兩細胞的花粉�？赡苁巧形闯墒旎蛟诋斍耙曇跋轮荒芸磧蓚�(gè)核。本實(shí)驗中出現的三核并不明顯，更多的是以雙核為主，三核現象也更多時(shí)候第三核并不完整，總結原因估計是在取樣階段采集的是尚未展開(kāi)的花朵。
3、在苯胺藍染色觀(guān)察胞間連絲的實(shí)驗中，在紫外激發(fā)下，看到蠶豆下表皮細胞呈藍色，其中較為明亮的光點(diǎn)即為胞間連絲。但在觀(guān)察中，發(fā)現熒光很迅速的發(fā)生淬滅，給觀(guān)察和拍照帶來(lái)了很大困難。在本實(shí)驗中選擇兩人配合以解決問(wèn)題。但是，通過(guò)查閱相關(guān)資料后，建議在制片的時(shí)候，加入適量的抗淬滅劑如p-phenylenediamine(PPD)、0.2%DABCO，來(lái)減慢熒光的淬滅速度。
七、思考題
1、結合本實(shí)驗，總結用于熒光觀(guān)察樣品的制備方法
根據生物樣品產(chǎn)生熒光的方式不同，往往分為以下三類(lèi)：
�。�1）自發(fā)熒光：在生物的某些組織中，經(jīng)紫外線(xiàn)照射后能直接發(fā)射出熒光的稱(chēng)為自發(fā)熒光或直接熒光。如植物組織中的葉綠素，經(jīng)紫外線(xiàn)照射后，即可發(fā)出紅色熒光；在400nm左右的激發(fā)光照射下，可直接觀(guān)察細胞壁纖維素所產(chǎn)生的綠色熒光等；一些具有GFP基因的生物編碼出的蛋白能發(fā)出綠色熒光。
對于這類(lèi)樣品的觀(guān)察，我們可以直接取材在熒光顯微鏡下觀(guān)察，但要根據樣品的熒光特性選取合適的激發(fā)光和發(fā)射光。
�。�2）次生熒光：有些生物組織經(jīng)紫外光照射后，并不能發(fā)出熒光，但是它可以吸收某些熒光染料并與與之結合，也可以產(chǎn)生熒光，這種稱(chēng)為次生熒光（或間接熒光）。如鬼筆環(huán)肽、DAPI等。
該方法就是采用常用的熒光染料染色，也是本實(shí)驗三種樣品的熒光標記方法。首先應該根據樣品選取能夠與之特異性結合的熒光染料，比如鬼筆環(huán)肽結合微絲、DAPI結合核DNA、甲苯胺藍結合胞間連絲的胼胝質(zhì)。隨后經(jīng)染色處理，根據染料的特異性選取適當波長(cháng)的激發(fā)光和發(fā)射光在熒光顯微鏡下進(jìn)行觀(guān)察。
�。�3）免疫熒光：這種染色法是利用抗原與抗體反應的原理，將熒光染料與抗體結合，然后將這種標記熒光染料的抗體再與相應抗原結合，即形成抗原、抗體復合物。經(jīng)一定波長(cháng)的光激發(fā)后，即可發(fā)射出熒光。以此辨認抗原在組織細胞內的分布狀況。這種方法被稱(chēng)為免疫熒光或熒光抗體法。
該方法是一種更為間接地觀(guān)察生物樣品熒光的方法。其關(guān)鍵在于抗原-抗體反應的選取與設計�？梢圆捎弥苯尤旧�，就是將熒光素直接與第一抗體結合，然后進(jìn)行抗原-抗體反應；也可采用間接染色法，即將熒光素與第二抗體結合，此法需要進(jìn)行兩次抗原-抗體反應。觀(guān)察時(shí)也需要注意調好光源，即選擇適當的波長(cháng)的激發(fā)光和發(fā)射光的選取。
此外，激光共聚焦掃描顯微鏡也可用來(lái)觀(guān)察樣品中熒光分布狀況，其可以在同一樣品的不同焦平面掃描得到圖像，通過(guò)計算機重構出樣品的三維結構，成像清晰，具有立體感。
參考文獻
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【2】王金發(fā)，何艷明，劉兵.細胞生物學(xué)實(shí)驗教程（第2版）.北京：科學(xué)出版社，2011
【3】王幼群，陳立群，劉毅敏，杜中.細胞生物學(xué)實(shí)驗教程.中國農業(yè)生物學(xué)生物學(xué)院細胞生物學(xué)教研組，2009
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