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論藥品微生物檢測實(shí)驗室的建立論文
微生物污染是藥品質(zhì)量評估的重要指標，目前各國藥典收錄的藥品無(wú)菌檢查和微生物限度檢查方法只對藥品終產(chǎn)品質(zhì)量進(jìn)行評價(jià)，且對無(wú)菌檢查不合格的藥品要求不得進(jìn)行復驗。藥品微生物檢測實(shí)驗室如缺少對實(shí)驗環(huán)境的監督和控制，則無(wú)法評估微生物陽(yáng)性結果的污染來(lái)源。而藥品檢測過(guò)程中的微生物陽(yáng)性結果可能源于實(shí)驗過(guò)程中環(huán)境的污染，因此判斷檢出菌與環(huán)境菌的相關(guān)性，是排除實(shí)驗過(guò)程污染、減少假陽(yáng)性結果、提高檢驗結果準確性的必不可少的環(huán)節。同時(shí)現階段藥品安全管理仍存在監管漏洞，當藥品受到致病微生物污染時(shí)，往往出現定溯源難、應變慢等問(wèn)題。若建立微生物檢測實(shí)驗室日常的環(huán)境微生物菌庫，則可較好地解決上述問(wèn)題。目前國外通過(guò)分子生物學(xué)手段對病原微生物建庫的研究較多，如RIDOM website 提供根據16S DNA 序列的差異建立的病原微生物庫[4]。國內對制藥環(huán)境建立環(huán)境微生物菌庫相關(guān)方面的研究也有報道，如PEI等[5]曾采用FTIR 法構建潔凈室環(huán)境菌的FTIR 譜庫，但該方法對微生物的培養條件及預處理要求嚴格，隨機誤差也較大。目前在藥品微生物檢測實(shí)驗室建立環(huán)境微生物菌庫方面的研究仍較少。本研究從筆者工作的藥品微生物檢測實(shí)驗室環(huán)境中不同部位、設備材料及活動(dòng)人員進(jìn)行連續7個(gè)月采樣收集微生物，共獲得248 株細菌和6 株霉菌，對收集的細菌采用全自動(dòng)微生物生化鑒定儀(Vitek2 Compact)進(jìn)行鑒定，對生化鑒定無(wú)確切結果的90 株細菌及6 株霉菌均采用3500 MicroSeq基因測序分析系統進(jìn)行細菌16S rDNA 和霉菌LSU rDNA 測序鑒定，并對某次采樣收集獲得的6株金黃色葡萄球菌采用Diversilab 進(jìn)行同源性分析。通過(guò)對鑒定結果的整理和分析，初步建立了藥品微生物檢測實(shí)驗室環(huán)境微生物庫，為今后本實(shí)驗室微生物檢測結果污染溯源調查提供了信息保障，同時(shí)也為制藥企業(yè)開(kāi)展建立環(huán)境微生物信息庫和微生物污染溯源提供了技術(shù)指導。
1 材料與方法
1.1 儀器與試劑光學(xué)顯微鏡( 日本奧林巴斯) ; VITEK 2Compact 全自動(dòng)微生物生化儀、全自動(dòng)革蘭氏染色儀、Diversilab 同源性分析系統(法國梅里埃);梯度96 孔Verti PCR 儀(美國ABI 公司);PowerpacBasic 電泳儀(美國B(niǎo)io-Rad 公司);3500 MicroSeq全自動(dòng)微生物基因分析鑒定系統(美國ABI 公司)。
1.2 環(huán)境微生物的收集連續7 個(gè)月對微生物實(shí)驗室環(huán)境中不同部位、活動(dòng)人員及設備材料采用胰蛋白胨大豆瓊脂(廣東環(huán)凱)平板，分別通過(guò)接觸碟法(人員身上取樣)、浮游菌采樣器(環(huán)境浮游微生物取樣)、空氣沉降法(環(huán)境沉降微生物取樣)及棉簽擦拭法(設備和材料表面取樣)進(jìn)行微生物樣本采集，分離純化后共獲得248 株細菌和6 株霉菌，采用甘油凍存管置?70 ℃冰箱保存。
1.3 生化鑒定采用VITEK 2 Compact 對獲得的248 株細菌的新鮮培養物根據革蘭染色鏡檢結果選取GN、GP、BCL 不同鑒定試劑卡進(jìn)行生化鑒定。
1.4 細菌16S rDNA 及霉菌LSU rDNA 測序鑒定對VITEK 鑒定無(wú)確切鑒定結果的90 株細菌及6 株霉菌分別采用3500 MicroSeq 全自動(dòng)微生物基因分析鑒定系統進(jìn)行細菌16S rDNA 和霉菌LSU rDNA 測序鑒定。采用3500 MicroSeq 系統配套試劑對90 株細菌和6 株霉菌的TSA 平板培養物分別進(jìn)行DNA 抽提、PCR 擴增和純化、標記反應及標記反應純化，最后進(jìn)行毛細管電泳測序。
1.5 6 株金黃色葡萄球菌的Diversilab 同源性分析某次采樣收集到6 株菌，采用VITEK 生化鑒定和16S rDNA 測序鑒定結果均為金黃色葡萄球菌，且在所測16S rDNA 基因片段中序列完全相同。為進(jìn)一步獲得6 株菌的分型信息，采用基于重復序列擴增技術(shù)的Diversilab 同源性分析系統進(jìn)行實(shí)驗。對6 株菌分別采用DiversiLab 儀器配套的金黃色葡萄球菌的rep-PCR 擴增試劑盒先進(jìn)行擴增，后吸取1 ?L PCR 產(chǎn)物加入芯片的標本孔，進(jìn)行電泳分離擴增的DNA的片段，采用儀器自帶軟件繪制基因分型同源性關(guān)系圖。
2 結果
2.1 菌株來(lái)源統計本次建庫收集到環(huán)境微生物分離菌株共計254 株，包括248 株細菌和6 株霉菌，所有的霉菌均來(lái)源于沉降菌收集。大部分菌株均來(lái)源于在微生物實(shí)驗室活動(dòng)的人員(137 株)，占全部分離菌株的53.9%。其余環(huán)境沉降微生物(30 株)、環(huán)境浮游微生物(47 株)及來(lái)源于設備和材料表面的微生物(40 株)占全部分離菌株比例相差不大，分別為11.8%，18.5%和15.7%。
2.2 環(huán)境微生物菌庫的建立結合生化鑒定和測序鑒定結果的254 株微生物的鑒定結果統計見(jiàn)表1。其中葡萄球菌屬細菌最多，占全部分離菌的34.3%;其次為芽孢桿菌和微球菌，分別占全部分離菌的32.7%和12.6%。環(huán)境沉降菌和空氣浮游菌共收集到77 株微生物，占污染微生物總數的30.3%。其中，芽孢桿菌、葡萄球菌和藤黃微球菌均為常見(jiàn)環(huán)境菌。從設備材料和操作人員共收集分離表面微生物177 株，占污染微生物總數的69.7%。污染微生物比例最高的分別為芽孢桿菌屬、藤黃微球菌和表皮葡萄球菌，分別占表面微生物總數的29.9%、15.8%和14.1%。采用生化鑒定和測序鑒定2 種方法對微生物實(shí)驗室環(huán)境中收集到的254 株菌進(jìn)行鑒定，通過(guò)鑒定結果的整理和分析，初步建立了藥品微生物檢測實(shí)驗室環(huán)境微生物庫。
2.3 6 株金黃色葡萄球菌的同源性分析結果6 株金黃色葡萄球菌采用Diversilab 系統進(jìn)行同源性分析，實(shí)驗結果顯示6 株金黃色葡萄球菌高度同源，最低菌株間的親緣關(guān)系也達到99%(親緣關(guān)系>95%，即為同源)，所以6 株菌應該來(lái)自同一個(gè)污染源。
3 討論
從建立的環(huán)境微生物庫各方面的對比情況分析可知，大部分微生物均來(lái)源于微生物實(shí)驗室中活動(dòng)的人員。葡萄球菌屬和微球菌屬細菌為人體易攜帶污染的微生物，這兩類(lèi)微生物在多個(gè)采樣點(diǎn)均有發(fā)現，所以可能是由于人員活動(dòng)或表面接觸帶來(lái)的交叉污染，表明操作人員攜帶的微生物是實(shí)驗室環(huán)境菌的主要來(lái)源之一，為了減少污染應嚴格控制人員的更衣和清潔程序。環(huán)境中同樣存在著(zhù)多種芽孢桿菌，在環(huán)境中不易被消毒滅菌，可能是由于消毒頻次和消毒劑效力問(wèn)題導致的殘留污染，應該增加消毒滅菌頻率并有計劃地更換消毒劑確保杜絕污染。本研究通過(guò)7 個(gè)月的持續采樣收集環(huán)境微生物，初步建立了藥品微生物檢測實(shí)驗室的環(huán)境微生物庫，但是環(huán)境微生物庫的建立是個(gè)持續動(dòng)態(tài)的過(guò)程，因此需要在日常監測中不斷完善。本次建庫采用微生物鑒定(生化鑒定和測序鑒定)和分型技術(shù)(Diversilab 同源性分析系統)對微生物實(shí)驗室進(jìn)行監控，建立和健全了日常監督檢查方法，為今后開(kāi)展污染水平的風(fēng)險評估和不良事件調查提供技術(shù)平臺，同時(shí)也為高風(fēng)險藥品生產(chǎn)企業(yè)建立環(huán)境微生物數據庫提供技術(shù)指導。
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