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蘆筍育種中生物技術(shù)的運用論文
0 引言
蘆筍是一種全球重要的經(jīng)濟作物，質(zhì)嫩味美，營(yíng)養豐富，被譽(yù)為"蔬菜之王"[1].近年來(lái)蘆筍種植及加工業(yè)在中國發(fā)展迅猛，2012年全國蘆筍種植面積已達180 萬(wàn)畝，是世界第一大蘆筍生產(chǎn)和出口國[1].但是，蘆筍在中國屬于舶來(lái)品，商業(yè)化生產(chǎn)歷史短，育種工作起步晚，品種資源匱乏，種子問(wèn)題上受制于人仍是中國蘆筍產(chǎn)業(yè)發(fā)展的瓶頸之一，亟需加快育種進(jìn)程，實(shí)現良種國產(chǎn)化。
蘆筍是典型的雌、雄異株作物，繁殖過(guò)程中長(cháng)期異交形成基因型高度雜合，即使品種內單株間也存在較大的差異，難以進(jìn)行嚴格意義上的自交，姊妹交基因純合速度慢。它又是多年生作物，可連續生長(cháng)10~20年，一般3年后才能測產(chǎn)，需要連續測產(chǎn)3~4年[2].因此，蘆筍育種工作復雜，育種周期較長(cháng)。近二三十年來(lái)組織培養技術(shù)成功用于蘆筍的無(wú)性繁殖，加速了優(yōu)良單株的擴繁和利用，花藥培養、DNA分子標記技術(shù)以及多倍體誘導等生物技術(shù)的應用豐富了育種途徑，蘆筍育種因而取得較大的成就。本文綜述國內外生物技術(shù)在蘆筍育種研究上的應用，并分析存在的問(wèn)題，探討蘆筍育種工作的未來(lái)發(fā)展方向，以期為今后蘆筍育種研究工作提供參考。
1 組織培養技術(shù)與蘆筍育種
1.1 蘆筍莖尖、腋芽離體培養及快繁
蘆筍最初無(wú)性繁殖方式只能采用分蔸法，1株生長(cháng)3~4年的根蔸只能分割出5~6株，分株率低，繁殖周期長(cháng)，速度慢，嚴重制約著(zhù)蘆筍種苗繁殖和品種選育，蘆筍組培快繁技術(shù)成功應用改變了這一不利局面。誕生于1976年的蘆筍第2代品種'UC157',即世界上第1 個(gè)無(wú)性系雜交品種（Clonal Hybrids），得益于期間蘆筍組培技術(shù)的應用，徹底克服由于姊妹交引起的品種嚴重退化，并解決了親本繁殖問(wèn)題，從此蘆筍品種選育進(jìn)入了一個(gè)全新階段。
早在1968年Wilmar與Hellendoorn[3]在《Nature》上報道了誘導獲得蘆筍胚狀體，并由此培養出完整的蘆筍植株，蘆筍也成為第1個(gè)組織培養成功的單子葉植物。隨后，各國研究者通過(guò)莖尖分生組織培養[4]、莖段腋芽培養[5],以及愈傷組織器官發(fā)生[6]或體細胞胚胎發(fā)生[7]等途徑研究蘆筍組培技術(shù)，均成功獲得與親本基因型一致的克隆苗。但是，蘆筍在組織培養中屬于難生根植物，20世紀80年代以前，一直沒(méi)有解決組培苗生根難題，因此限制蘆筍組培技術(shù)的廣泛應用。1981年周維燕等[8]通過(guò)改變激素種類(lèi)和濃度配比，將蘆筍雞爪根誘導率由20%~30%提高到了44.4%.Chin[9]、Khunachak 等[10]在生根培養基中加入 GA 抑制劑嘧啶醇（Ancymindol）使生根率提高到 90%~100%.
Desjardins 等[11]采用繁殖根叢策略，即首先誘導培養莖段腋芽形成根叢（crown），然后快繁根叢，再誘導生根，極大提高了繁殖系數和生根率。陳光宇等[12]采用繁殖根叢策略和兩段法生根培養，使繁殖系數達到5.3以上，生根率達到100%.最近，Carmona-Martín等[13]開(kāi)發(fā)出一種新穎、快捷、高效的天門(mén)冬屬植物組培快繁方法，以植株根莖芽作為外植體，芽誘導和生根均在根莖芽培養基上，整個(gè)系統采用一步法，大約8周即可出瓶移栽，平均成活率達80%.Regalado等[14]
進(jìn)一步優(yōu)化了該組培快繁方法，以修改的MS培養基作為根莖芽培養基，用85.7 mg/L EDDHA-Fe替代MS培養基中的EDTA-Fe 和維生素，并添加 0.3 mg/L NAA、0.1 mg/LKIN、2 mg/L 嘧啶醇和 6%蔗糖。結果表明：外植體誘導成苗率達70%,一步法生根率為30%~45%;增加一個(gè)培養周期生根率提高至60%~85%,增加2個(gè)培養周期生根率達到100%;試管苗移栽成活率高于90%.此方法同樣適合于蘆筍栽培品種組培快繁，生根快，周期短，但可能存在繁殖系數不高、外植體不易消毒等缺點(diǎn)。
1.2 蘆筍花藥培養與小孢子培養
蘆筍供體雄株Mm產(chǎn)生2種基因型小孢子M和m,運用花藥培養或小孢子培養技術(shù)進(jìn)行培養，誘導雄核發(fā)育，可培育形成單倍體花粉植株M和m,它們經(jīng)人工誘導加倍處理或自發(fā)加倍形成產(chǎn)生雙單倍體植株MM（超雄株）或 mm（純合雌株），進(jìn)而培育全雄品種（mm × MM→Mm,子代全部為雄株）和強zz優(yōu)勢組合，加速基因純合，縮短育種進(jìn)程，因此，花培技術(shù)在多年生雌、雄異株作物蘆筍育種中的作用尤為突出。
1.2.1 花藥培養 Pelletier[15]首次采用蘆筍花藥培養成功獲得單倍體細胞團（n=10）。隨后Dore[16]在Pelletier工作基礎上，成功獲得單倍體植株，并通過(guò)人工加倍法得到超雄株和純合的二倍體雌株，然后組織培養繁殖DH 單株，雌雄 DH 系配組雜交，獲得早熟高產(chǎn)的全雄組合。1985年Falavigna等[17]通過(guò)花藥培養成功地推出'Eros'、'Ringo'、'Golia'和'Argo'4個(gè)優(yōu)良全雄品種。目前蘆筍花藥培養技術(shù)已成為國際上蘆筍全雄品種培育主要途徑之一。國內20世紀80年代起，如周維燕等[18]、張磊等[19]、丁鑫等[20]、林宗鏗等[21]、陳海媛等[22]先后開(kāi)展了蘆筍花藥培養技術(shù)研究，對花藥培養的外植體取材與預處理，培養基篩選，誘導培養方法，倍性鑒定與移栽，以及控制體細胞干擾等方面進(jìn)行了研究，已獲得花藥培養的單倍體和純合二倍體等花培植株。
蘆筍花藥培養一般以小孢子發(fā)育處于單核晚或末期的花藥進(jìn)行接種誘導效果較佳，通常以MS培養基為基本培養基，配以不同的植物生長(cháng)調節劑組合，誘導雄核發(fā)育，通過(guò)胚狀體或愈傷途徑，獲得花培苗，其關(guān)鍵是雄核發(fā)育的誘導，促進(jìn)小孢子啟動(dòng)分裂。目前國內較多是通過(guò)誘導花藥愈傷途徑[19-22]獲得花培植株。
彭新紅等[23]則是通過(guò)誘導蘆筍花藥雄核發(fā)育胚狀體途徑獲得花培植株，建立了一種效率較高的花藥培養誘導胚狀體方法，篩選出較優(yōu)的花藥胚狀體誘導培養基是MS培養基，另添加0.01 mg/L NAA、2.0 mg/L 6-BA、1.0 mg/L 2,4-D、50 g/L 蔗糖。最近 Ercan 等[24]結果表明，小孢子處于單核末期的花藥在添加了0.5 mg/L BA和1 mg/L NAA的MS培養基上培養，胚狀體誘導率最高，達到8.33%,最后成苗率達到13.33%.
1.2.2 小孢子培養 小孢子培養能夠較好避免體細胞干擾。閆鳳英等[25]對蘆筍花粉粒進(jìn)行離體培養，誘導產(chǎn)生了愈傷組織，經(jīng)再分化培養形成單倍體植株（n=10）。Zhang 等[26]研究報道，蘆筍游離小孢子在添加1.0 mg/L 2,4-D 和 0.5 mg/L BA 的液體 MS 培養基中誘導培養，獲得高頻率的小孢子胚和愈傷組織；將愈傷轉移至添加1.0 mg/L 2,4-D和0.2 mg/LBA的固體MS培養基上培養，6周后獲得單倍體再生植株。Peng等[27]
研究表明，培養基成分、花蕾低溫預處理時(shí)間、花藥共培養時(shí)間等因素均影響蘆筍小孢子分裂頻率和愈傷組織產(chǎn)率，最優(yōu)處理是：基因型G459花蕾4℃低溫預處理7~9 天，在含 6%蔗糖、1 mg/L NAA、0.1 mg/L 6-BA 的液體培養基上共培養花藥與游離小孢子14天；4天后2%游離小孢子分裂形成小愈傷組織；每 100 個(gè)花藥產(chǎn)生約140塊愈傷組織；在4種再生培養基上培養，分別有19.6%~21%和3.9%~8.0%愈傷組織產(chǎn)生了幼苗和胚芽；最后成苗的植株中，單倍體占49%、二倍體占34%、三倍體占4%、四倍體占11%.湯泳萍等[28]研究表明，單核晚期是蘆筍游離小孢子培養適宜發(fā)育時(shí)期，小孢子變溫預處理效果顯著(zhù)，小孢子啟動(dòng)分裂（膨大率）比對照高出6倍，最高達22.5%,小孢子培養的適宜培養基為添加0.5 mg/L 6-BA、1.0 mg/L NAA、0.2 mg/L 2,4-D、400 mg/L Glu 和 6%蔗糖的 MS 培養基。
1.3 原生質(zhì)體培養
原生質(zhì)體培養可為蘆筍遺傳育種創(chuàng )造細胞無(wú)性系變異和突變體，為基因工程提供理想的受體，以及奠定細胞融合工作基礎。蘆筍品種資源遺傳背景狹窄，通過(guò)原生質(zhì)體融合有助于克服種間雜交障礙，打破傳統育種的限制，引進(jìn)近緣野生種優(yōu)異基因，創(chuàng )制優(yōu)異新種質(zhì)新材料，培育優(yōu)良新品種，因此，蘆筍原生質(zhì)體培養是一件非常有意義的研究工作。早在1975年Bui等[29]從蘆筍擬葉的葉肉細胞分離得到原生質(zhì)體，培養形成愈傷組織，并由愈傷組織誘導獲得了再生植株。由此，蘆筍成為第一個(gè)原生質(zhì)體培養成功的單子葉植物。楊麗軍和許智宏[30]利用蘆筍胚性愈傷組織作為分離原生質(zhì)體的起始材料，建立了合適的原生質(zhì)體培養系統。
Chen 等[31]研究表明，KM8P是蘆筍原生質(zhì)體培養比較適宜的培養基，培養 2 天的原生質(zhì)體植板率可高達20%,約 25%啟動(dòng)分裂的原生質(zhì)體發(fā)育形成體細胞胚，共約0.8%最初分離出的原生質(zhì)體培養再生出完整植株。尹富強等[32]獲得高質(zhì)量的田間栽植蘆筍嫩莖原生質(zhì)體。Kunitake[33]電擊法成功誘導A. macowanii與蘆筍栽培種原生質(zhì)體融合，但獲得的體細胞zz不育。
2 分子標記技術(shù)與蘆筍育種
蘆筍重要農藝性狀多為復雜的數量性狀，受微效多基因和環(huán)境的共同作用，因此，在遺傳改良中對基因型選擇的依賴(lài)性更為突出。借助現代分子標記技術(shù)開(kāi)展蘆筍分子育種，可以顯著(zhù)提高選擇效率，縮短育種周期。目前蘆筍分子標記技術(shù)主要包括以下2個(gè)方面。
2.1 遺傳圖譜的構建
高密度的分子遺傳圖譜是目標性狀基因（QTL）定位、克隆與分子標記育種等研究的基礎。由于蘆筍作圖群體構建困難等原因，已公開(kāi)發(fā)表的蘆筍基因組遺傳圖譜只有4張。Lewis[34]以2個(gè)雜合親本雜交F1的部分雙列雜交群體作為作圖群體，運用RFLP標記技術(shù)構建了蘆筍首張基因組遺傳圖譜；Jiang等[35]使用同樣的作圖群體，運用RFLP、RAPD和同工酶標記加密了蘆筍第1張基因組遺傳圖譜；Spada等[36]以2個(gè)雌雄雙單倍體雜交F1群體作為作圖群體，運用RFLP、RAPD、AFLP 和同工酶標記構建了蘆筍第 3 張基因組遺傳圖譜，總共274個(gè)標記定位到10個(gè)連鎖群上，總遺傳距離為 721.4 cM,平均遺傳距離和最大遺傳距離分別是7.9 cM 和 29 cM.Mercati 等[37]采用454平臺高通量測序抗、感銹病轉錄本，檢測出符合分析條件的1800個(gè)SNP 和 1000 個(gè) SSR 位點(diǎn)，從中開(kāi)發(fā)出基于 EST 的 144個(gè)SNP和60個(gè)SSR分子標記，利用239個(gè)單株BC1群體將81個(gè)標記（65個(gè)SNP、15個(gè)SSR、1個(gè)STS）初步定位在13個(gè)連鎖群上，總遺傳距離為773.5 cM,平均遺傳距離是10.2 cM.其中上圖標記可以用來(lái)進(jìn)行種質(zhì)資源鑒定與遺傳多樣性分析。最近Mercati等[38]利用上述144個(gè)SNP對國際上廣泛使用的花藥培養來(lái)源的DH 系和品種進(jìn)行檢測分析，結果證實(shí)了現代蘆筍種質(zhì)遺傳背景相當狹窄，許多 DH 系均帶有早期品種'Mary Washington'的血緣。
2.2 與重要性狀連鎖的分子標記開(kāi)發(fā)與應用
當前蘆筍重要功能基因（QTL）挖掘與標記開(kāi)發(fā)，主要集中于蘆筍性別，其他目標性狀研究幾乎未見(jiàn)報道，由此，蘆筍分子標記前景選擇僅局限于雌、雄性別。尋找和定位與蘆筍性別決定基因連鎖的DNA分子標記，國內外先后許多研究報道[39-46],目前構建了圍繞蘆筍性別決定基因M比較精細的遺傳圖譜，將M定位在L5染色體著(zhù)絲點(diǎn)附近的0.63 cM區域內[41],其中開(kāi)發(fā)的部分分子標記已用于雌雄株篩選。國內韓瑩琰等[42]運用BSA法篩選蘆筍雌雄基因池，獲得E-ACG/M-CTT-156 多態(tài)性片段與 M 基因連鎖，遺傳距離為8.33 cM.周勁松等[43]利用前人開(kāi)發(fā)的DNA分子標記Asp1-T7 和 Asp1-T7sp 早期快速鑒別蘆筍雌株和雄株，并結合測交篩選出超雄株。李書(shū)粉等[44]通過(guò)AFLP擴增篩選獲得與蘆筍雄性連鎖的AFLP和SCAR標記。
最近 Kanno 等[45]將蘆筍一個(gè)雄性特異 RAPD 標記T35R54-1600 成功轉化為一個(gè) STS 標記 MSSTS710,能 夠 鑒 定 8 個(gè) 蘆 筍 品 種 雌 、雄 性 別 ,即'MaryWashington 500W'、'UC157'、'Harumachi Green'、'Super Welcome'、'F4'、'Pacific 2000'、'F2'和'Backlim'.Patricia等[46]利用雄性連鎖標記Asp1-T7和EST-SSR背景選擇標記成功從西班牙本土'Moradode Huétor'兩性株后代群體中篩選到四倍體超雄株。
3 蘆筍的遺傳轉化研究
早在l987年Bytebier等[47]將含有氨基糖苷磷酸轉移酶（NOS-APH）基因的重組質(zhì)粒pGV3850:1103neo轉化蘆筍愈傷組織，經(jīng)卡那霉素篩選獲得再生植株，分子雜交證明外源基因整合至蘆筍核基因組上，由此，蘆筍成為第一個(gè)轉基因成功的單子葉植物。目前蘆筍農桿菌介導法[47-49]、基因槍法[50-51]、電擊法[52-54]等轉基因技術(shù)已比較成熟。其中，Li 等[51]利用基因槍將 NPTII 和uidA 基因同時(shí)轉入蘆筍懸浮細胞中，獲得 10 個(gè)轉基因植 株 ,在 莖 和 擬 葉 中 均 檢 測 到 uidA 表達 .
Mukhopadhyay 等[52]利用電擊法將NPT II和GUS基因導入蘆筍胚性愈傷產(chǎn)生的原生質(zhì)體中，并獲得轉基因再生植株。由于蘆筍是異交授粉植物，轉基因植株后代遺傳規律相對復雜。Limanton-Grevet與Julien將含3~4個(gè)T-DNA拷貝的6個(gè)轉基因植株與非轉基因植株雜交，獲得6株T1植株，分析它們GUS活性和卡那霉素抗性，結果發(fā)現：3個(gè)T1符合孟德?tīng)栆粚?:1分離比例，且T-DNA插入在T0代相同的位點(diǎn)，其他3株則呈現非孟德?tīng)柗蛛x；T2代也表現非孟德?tīng)柗蛛x；無(wú)GUS 活性和卡那霉素抗性的植株，并不含有任何 T-DNA,不適合用來(lái)分析非孟德?tīng)柗蛛x。但由于蘆筍是蔬菜，涉及到食品安全等問(wèn)題，國內外尚無(wú)轉基因蘆筍品種問(wèn)世。從長(cháng)遠發(fā)展角度看，國內有必要開(kāi)展蘆筍轉基因技術(shù)研究?jì)涔ぷ鳌?/p>
4 多倍體育種
蘆筍染色體基數x=10,栽培品種多為二倍體（2n=2x=20），但生產(chǎn)也有些多倍體品種，如紫色四倍體品種'Purple Passion'、'Pacific Purple'、'Sweet Purple',綠色四倍體品種'Seto Green',三倍體綠蘆筍品種'Hiroshima Green',它們一般比二倍體品種植株高大，嫩莖粗壯，筍商品性好。由于蘆筍屬于莖菜，以植物體嫩莖為主要收獲對象，多倍體細胞遺傳學(xué)缺陷影響小，且染色體基數較少，多倍體育種潛力較大。
秋水仙素是在蘆筍多倍體誘變中應用較多的化學(xué)誘變劑。Braak 等[56]、Skiebe 等[57]以秋水仙素為誘變劑，處理萌發(fā)的蘆筍種子，均成功獲得四倍體蘆筍植株。韓成云等[58]以秋水仙素為誘變劑，用浸泡法和涂抹法處理蘆筍試管苗，進(jìn)行多倍體誘導。結果表明：以0.10%秋水仙素為誘變劑，用涂抹法處理 72 h 的效果較佳，形態(tài)學(xué)分析顯示其加倍率可達94%;對多倍體材料進(jìn)行染色體鑒定，涂抹法染色體加倍效果（細胞加倍率96.1%）也優(yōu)于浸泡法（細胞加倍率86.4%）。最近Carmona-Martin 等[59]使用秋水仙堿溶液處理西班牙本土四倍體品種'Morado de Huetor'根莖芽，成功獲得八倍體植株，其中0.1%秋水仙堿溶液80 r/min旋轉震蕩處理 24 h 效果最佳，八倍體誘導率達 7%,混倍體3.5%,獲得的八倍體植株在株高、筍粗、冠層面積等農藝性狀顯著(zhù)優(yōu)于原始四倍體植株。
蘆筍多倍體育種另一途徑是通過(guò)種間雜交或者不同倍性品種間有性雜交分離獲得。Moreno等[60]研究發(fā)現，西班牙本土品種'Morado de Huetor'具有豐富的染色體倍性變異，包括2n=2x,3x,4x,5x,6x,8x等植株，但以四倍體植株為主，這因為'Morado de Huetor'屬于四倍體的蘆筍栽培品種與A. maritimus種間zz，可以從分離出遺傳穩定的多倍體植株。Moreno等[61]利用蘆筍四倍體品種與二倍體品種相互雜交，從zz后代中分離獲得整三倍體植株。
5 小結與展望
綜上所述，現代生物技術(shù)在蘆筍遺傳育種中研究應用起步比較早，在單子葉植物中3項第一，蘆筍也堪稱(chēng)為早期模式單子葉植物，蘆筍育種生物技術(shù)已取得較好的成就，并成為蘆筍種質(zhì)創(chuàng )新與品種改良的重要手段，但是仍存在著(zhù)一些問(wèn)題：
�。�1）進(jìn)入21世紀，蘆筍原生質(zhì)體培養、遺傳轉化以及小孢子培養等生物技術(shù)研究報道很少，甚至呈現停滯狀態(tài)，至今尚無(wú)轉基因蘆筍品種問(wèn)世，蘆筍原生質(zhì)體融合成功實(shí)例也極少。
�。�2）國外先后報到了蘆筍病毒病AV-1[62]、AV-2[63]、AV-3[64],亟需盡快開(kāi)展蘆筍脫毒快繁技術(shù)研究。
�。�3）國內花藥培養研究報道不少，實(shí)踐中也獲得了單倍體、雙單倍體植株，但成功應用于全雄育種的實(shí)例并不多。
�。�4）分子標記技術(shù)在蘆筍上的應用仍落后于其他園藝作物，現有的遺傳圖譜密度過(guò)低，分子標記少，除了雌、雄性別，缺乏與其他目標性狀連鎖的分子標記。
鑒于此，并根據蘆筍生物學(xué)特性和產(chǎn)業(yè)發(fā)展需求，建議今后蘆筍生物技術(shù)育種工作中重點(diǎn)關(guān)注以下方向的研究：
�。�1）以拓寬遺傳背景為重點(diǎn)進(jìn)行種質(zhì)創(chuàng )新，積極開(kāi)展蘆筍種間雜交技術(shù)研究，將近緣野生種質(zhì)優(yōu)異性狀導入栽培品種，綜合運用組培快繁、花藥培養和DNA分子標記輔助選擇等生物技術(shù)，提高zz后代目標基因型選擇效率，加快基因純合速度，培育生產(chǎn)中亟需的抗莖枯病、富含功能活性物質(zhì)等新種質(zhì)新品系。
�。�2）國內蘆筍花藥和小孢子培養研究，應致力于解決體細胞干擾、誘導率低、鑒定困難以及移栽成活率低等難題，切實(shí)建立起一套可操作性強、行之有效的蘆筍花藥和小孢子培養技術(shù)體系，并與蘆筍全雄品種和zz優(yōu)勢利用實(shí)踐緊密結合。
�。�3）鑒于蘆筍多年生和雌雄異株等生長(cháng)繁殖習性，人工種子將有良好的應用前景，加強基于體細胞胚發(fā)生途徑的組培快繁技術(shù)研究，提高體細胞胚誘導率，控制體細胞變異，在此基礎上研發(fā)蘆筍人工種子，可能是蘆筍組織培養未來(lái)發(fā)展方向之一。
�。�4）蘆筍基因組測序已完成，精細的基因組圖譜即將公布，以此為研究平臺，積極開(kāi)發(fā)前景和背景選擇標記系統，走向基因組輔助育種和分子設計育種，并融合傳統育種，將是蘆筍新品種培育必然的發(fā)展趨勢。
參考文獻：
[1] 陳光宇。中國蘆筍產(chǎn)業(yè)發(fā)展現狀與趨勢[J].世界農業(yè)，2013,10:181-186.
[2] 王小佳。蔬菜育種學(xué)（各論）[M]. 北京：中國農業(yè)出版社，2000: 241.
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