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測定梅花點(diǎn)舌丹中華蟾酥毒基與脂蟾毒配基含量實(shí)驗報告
1、儀器與試藥
日立L-2130高效液相色譜儀；日立L-2420紫外檢測器；大連依利特Echrom型色譜工作站；島津2401紫外分光光度計；超聲波清洗器SK252H型(上海產(chǎn))；分析天平(上海良平精密儀器有限公司,Max100 g,D=0.000 1 g)。 華蟾酥毒基(批號110803-200504)和脂蟾毒配基(批號110718-200507)對照品購自中國藥品生物制品檢定所,供含量測定用。乙腈、甲醇(天津四友)為色譜純,其他試劑均為分析純。水為重蒸水。
2、溶液的配制
2.1 供試品溶液的配制
取重量差異項下的本品,研細,約1.5 g,精密稱(chēng)定,置錐形瓶中,精密加入甲醇25 mL,稱(chēng)定重量,超聲處理(功率250 W,頻率59 kHz)30 min,放冷,再稱(chēng)定重量,用甲醇補足減失的重量,搖勻,濾過(guò),即得。
2.2 陰性樣品溶液的制備
取缺蟾酥陰性樣品,按“2.1”項下方法操作,即得。
2.3 對照品溶液的制備
取華蟾酥毒基對照品15.94 mg,精密稱(chēng)定,取脂蟾毒配基對照品18 mg,精密稱(chēng)定,分別置25 mL量瓶中,用甲醇溶解(必要時(shí)超聲)并稀釋至刻度,搖勻,分別精密量取各1 mL,分別置10 mL量瓶中,用甲醇稀釋至刻度,搖勻,即得對照品溶液(每1 mL含華蟾酥毒基63.75 μg、脂蟾毒配基72.00 μg)。
3、色譜條件
用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑：乙腈-水(43.5∶56.5)為流動(dòng)相；柱溫：室溫；流速：1.0 mL/min；檢測波長(cháng)為296 nm；進(jìn)樣量：20 μL。理論板數按華蟾酥毒基、脂蟾毒配基峰計算不低于2 700。色譜圖見(jiàn)圖1。
4、方法學(xué)驗證
4.1 線(xiàn)性關(guān)系
取華蟾酥毒基和脂蟾毒配基對照品,精密稱(chēng)定,用甲醇稀釋制成華蟾酥毒基為5.31、10.63、21.25、42.50、63.75 μg/mL和脂蟾毒配基為6.00、12.00、24.00、48.00、72.00 μg/mL的系列。取上述溶液20 μL,注入液相色譜儀,測定。結果華蟾酥毒基線(xiàn)性方程為Y=21.57X+10.15,相關(guān)系數r=0.999 8；脂蟾毒配基線(xiàn)性方程為Y=18.79X-10.56,相關(guān)系數r=0.999 7。結果表明,華蟾酥毒基、脂蟾毒配基對照品分別在5.31～63.75 μg/mL、6.00～72.00 μg/mL范圍內與峰面積積分值呈現良好線(xiàn)性關(guān)系。
4.2 精密度試驗
取同一供試品,分別按“2.1”項下方法制備供試品溶液。精密吸取20 μL,注入液相色譜儀,依法連續進(jìn)樣6次。結果華蟾酥毒基RSD=2.89%,脂蟾毒配基RSD=1.50%；表明精密度良好。取同一供試品溶液,在0、2、4、6、8、10、24 h不同時(shí)間內,分別精密吸取20 μL,注入液相色譜儀,進(jìn)行測定。結果華蟾酥毒基RSD=2.89%,脂蟾毒配基RSD=2.40%；表明供試品溶液在24 h內基本穩定。精密稱(chēng)取本品約1.5 g,共6份,分別按“2.1”項下方法制備供試品溶液,于上述色譜條件下連續測定,分別計算華蟾酥毒基和脂蟾毒配基含量(n=6),RSD分別為2.38%和2.96%。精密稱(chēng)取同一供試品,共6份,分別精密加入華蟾酥毒基、脂蟾毒配基對照品,分別按“2.1”項下方法制備供試品溶液,于上述色譜條件下連續測定,計算各樣品中華蟾酥毒基、脂蟾毒配基的含量,并計算回收率。結果見(jiàn)表1。表1 華蟾酥毒基、脂蟾毒配基回收率實(shí)驗結果 （略）
4.3 樣品含量測定
取本品各批約1.5 g,精密稱(chēng)定,分別按“2.1”項下同法操作制備供試品溶液,于上述色譜條件下連續測定,計算各樣品中華蟾酥毒基、脂蟾毒配基的含量。本品為中藥復方制劑,組分復雜,經(jīng)實(shí)驗發(fā)現,樣品的提取及前處理對華蟾酥毒基和脂蟾毒配基的含量測定及各組分的分離影響較大,故對樣品的提取及前處理條件進(jìn)行了篩選。為確定用何種溶劑提取、溶劑的用量、超聲處理的時(shí)間,我們參考2005年版《中國藥典》(一部)梅花點(diǎn)舌丸、麝香保心丸及蟾酥藥材等項下的含量測定方法[1],采用正交設計方法安排實(shí)驗。實(shí)驗結果表明,提取液用甲醇,溶液劑量25 mL,超聲處理30 min,可得到滿(mǎn)意的結果。
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