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微生物限度檢查法標準操作規程
一、目的：建立微生物限度檢查的基本操作規程，為微生物檢查人員提供正確的操作規程。
二、適用范圍：適用于品管化驗室的微生物限度檢查。
三、職責：品管微生物檢驗員對本標準的實(shí)施負責。
四、正文：
1定義：微生物限度檢查法：系指非規定滅菌制劑及其原輔料受到微生物污染程度的一種檢查方法，包括染菌量及控制菌的檢查。2實(shí)驗用具：
電熱恒溫培養箱、電熱恒溫水溫箱、試管、刻度吸管、量筒、三角瓶、培養皿、試管架、注射器、針頭、注射器盒、研缽、75%酒精棉球、紫外燈（365nm波長(cháng)）。
3培養基：
3.1營(yíng)養瓊脂培養基、孟加拉紅培養基、乳糖膽鹽培養基、蛋白胨水培養基。
3.2培養基的管理、配制應符合檢定菌、培養基管理規程、培養基配制規程。
4試液：甲基紅試液、a-奈酚乙醇試液、40%氫氧化鉀溶液、靛基質(zhì)試液。
5稀釋劑：0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液。
6供試品溶液的制備：取供試品（供試品如為固體，置研缽中研磨成細粉）放入試管中，加入適量的稀釋劑制成1：10濃度的供試品溶液。
7對照用菌液：控制菌檢查均應作相應已知菌的對照試驗，對照菌株為大腸桿菌[CMCC（B）441022]。取相應菌株的營(yíng)養瓊脂培養基斜面新鮮培養物1白金耳，接種至營(yíng)養肉湯培養基內，培養18-20小時(shí)，稀釋至1：106，對照菌的加入量為50-100個(gè)。
8檢查法：
8.1除另有規定外，細菌的培養溫度為30-35℃，霉菌的培養溫度為
25-28℃，控制菌的培養溫度為35±1℃。
8.2細菌、霉菌計數：
8.2.1平皿菌落計數法取均勻供試液，進(jìn)一步稀釋成1：102、1：103等適宜的稀釋級。分別取連續三級10倍稀釋的供試液各1ml，置直徑約90mm的平皿中，再注入約45℃的培養基約15ml，混勻，等凝固后，倒置培養，每個(gè)稀釋級應作2~3個(gè)平皿。
營(yíng)養瓊脂培養基用于細菌計數，玫瑰紅鈉瓊脂培養基用于霉菌計數。
8.2.2菌數測定陰性對照試驗取供試驗用的稀釋劑各1ml，置4個(gè)無(wú)菌平皿中，分別按細菌、霉菌計數用的培養基制備平板，培養，檢查，不得長(cháng)菌。
8.2.3細菌培養時(shí)間為48小時(shí)，分別在24小時(shí)及48小時(shí)點(diǎn)計菌落數，一般以48小時(shí)菌落數為準，霉菌培養時(shí)間為72小時(shí)，分別在48小時(shí)及72小時(shí)點(diǎn)計菌落數，一般以72小時(shí)菌落數為準。菌落如蔓延生長(cháng)成片，不宜計數。
8.2.4點(diǎn)計后，計算各稀釋級的平均菌落數，按菌數報告規則報告菌數。
8.2.5菌數報告規則：細菌宜選取平均菌落數在30-300之間的稀釋級，霉菌宜選取平均菌落數在30-100之間的稀釋級，作為報告菌數計算的依據。如只有1個(gè)稀釋級菌落數在30-300（30-100）
之間時(shí)，將該稀釋級的菌落數乘以稀釋倍數報告，如同時(shí)有兩個(gè)稀釋級在30-300（30-100）之間時(shí)，按下式計算兩級比值。
比值=低稀釋級平均菌落數稀釋倍數
高稀釋級平均菌落數稀釋倍數
.當比值≤2時(shí)，以?xún)上♂尲壍木祱蟾�，當比值�?時(shí)以低稀釋級平均菌落數乘以稀釋倍數報告，如同時(shí)有3個(gè)稀釋級的平均菌落數均在30-300（30-100）之間時(shí)，以后兩個(gè)稀釋級計算級間比值，如各稀釋級的平均菌落數均不在30-300（30-100）之間，以最接近30或300的稀釋級平均菌數乘以稀釋倍數報告，如各稀釋級平均菌落數均在300（100）以上，按最高稀釋級菌落數乘以稀釋倍數報告，如各
稀釋級平均菌落數均小于30時(shí)，一般按最低稀釋級的菌落數乘以稀釋倍數報告，如當1：10（1：100）稀釋級平均菌落數等于或大于原液（或1：10）時(shí)，應以培養基稀釋法測定，按測定結果報告菌數。
8.2.6培養基稀釋法：取供試液（原液或1：10供試液）3份，每份各1ml，分別注入5個(gè)平皿內（每皿各0.2ml）每個(gè)平皿中傾注營(yíng)養瓊脂培養基約15ml，混勻，凝固后倒置培養，計數，每1ml注入的5個(gè)平板點(diǎn)計的菌落數之和即為每1ml的菌落數，共得3組數據，以3份供試液菌落數的平均值乘以稀釋倍數報告。
如各稀釋級平板均無(wú)菌落生長(cháng)，或僅最低稀釋級平均菌落數小于1時(shí)，則報告菌數為小于10個(gè)。
8.3控制菌檢查除另有規定外，取供試液10ml（相當于供試品1g、1ml、cm2），直接或處理后接種，經(jīng)增菌、分離培養后，進(jìn)行革蘭氏染色、生化試驗等項檢查。
8.3.1大腸菌群：
8.3.1.1檢樣稀釋及培養
�、僖詿o(wú)菌操作，將檢樣25g（ml）放于含有225ml滅菌生理鹽水的滅菌玻璃瓶?jì)龋ㄆ績(jì)阮A置適當數量的玻璃珠），經(jīng)充分振搖或研磨做成1：10的均勻稀釋液。固體檢樣在加入稀釋液后，最好在均質(zhì)器中以8000—10000r/min的速度處理1min，作成1：10的均勻稀釋液。
�、谟�1ml滅菌吸管吸取1：10稀釋液1ml，沿管壁徐徐注入含有9ml滅菌生理鹽水的試管內（注意吸管尖不要接觸管內稀釋液），混合均勻，做成1：100的稀釋液。
�、哿砣�1ml滅菌吸管，按上述操作順序，做10倍遞增稀釋液。如此每次遞增稀釋一次，即換用一支1ml滅菌吸管。
�、芨鶕称沸l生標準要求或標本污染情況的估計，選擇3個(gè)合適的稀釋度，每個(gè)稀釋度接種三管。
8.3.1.2乳糖發(fā)酵試驗
將待檢樣品接種于乳糖膽鹽發(fā)酵管內，接種量在1ml以上者，用雙
料乳糖膽鹽發(fā)酵管，
1ml及1ml以下者，用單料乳糖膽鹽發(fā)酵管。每一稀釋度接種三管，置36±1℃溫箱內，培養24±2h，如所有乳糖膽鹽發(fā)酵管都不產(chǎn)氣，則可報告為大腸菌群陰性，如有產(chǎn)氣者，則按下列程序進(jìn)行。
8.3.1.3分離培養
將產(chǎn)氣的發(fā)酵管分別轉種在伊紅美藍瓊脂平板上，置36±1℃溫箱內，培養18~24h，然后取出，觀(guān)察菌落形態(tài)，并做革蘭氏染色和證實(shí)試驗。
8.3.1.4證實(shí)試驗
在上述平板上，挑取可疑大腸菌群菌落1~2個(gè)進(jìn)行革蘭氏染色，同時(shí)接種乳糖發(fā)酵管，置36±1℃溫箱內，培養24±2h，觀(guān)察產(chǎn)氣情況。凡乳糖管產(chǎn)氣，革蘭氏染色為陰性的無(wú)芽孢桿菌，即可報告為大腸菌群陽(yáng)性。
8.3.1.5報告：根據證實(shí)為大腸菌群陽(yáng)性的管數，查MPN檢索表，報告每100ml（g）大腸菌群的MPN值。
9結果判斷：
9.1細菌菌落數、霉菌菌落數、控制菌三項均符合該品種微生物限度項下的規定，應判為供試品符合規定；其中任何一項不符合該品種項下規定，應判供試品不符合規定。
9.2細菌菌落數、霉菌菌落數第一次測定超過(guò)該品種項下微生物限度規定時(shí)，應從同一批號樣品中隨機抽樣，復試兩次，以三次結果平均值報告。
9.3如營(yíng)養瓊脂培養基平板上生長(cháng)霉菌菌落數或玫瑰紅鈉瓊脂培養基平板上生長(cháng)細菌菌落數超過(guò)該品種項下微生物限度規定時(shí)，經(jīng)復試2次，如3次結果平均值仍超過(guò)規定，應判為供試品不符合規定。
9.4各類(lèi)制劑檢出控制菌或其他致病菌時(shí)，按第一次檢出結果為準，不再抽樣復試，即應判該供試品不符合規定。
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