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微生物量：微生物大小及數量的測定
微生物大小及數量的測定
一、實(shí)驗目的
1.學(xué)習并掌握用測微尺測定微生物細胞大小的方法。2.了解血細胞計數板的構造及計數原理。
3.掌握使用血細胞計數板進(jìn)行微生物計數的方法。
二、實(shí)驗原理
1.微生物大小測定原理
微生物細胞的大小是微生物的形態(tài)特征之一，也是分類(lèi)鑒定的依據之一。其測量工具有目鏡測微尺和鏡臺測微尺。鏡臺測微尺是中央部分刻標準刻尺的載玻片，其尺度總長(cháng)為1mm，精確分為10個(gè)大格，每個(gè)大格又分為10個(gè)小格，共100小格，每一小格長(cháng)度為0.01mm，即10μm。如圖1。
圖1鏡臺測微尺中央部分及鏡臺測微尺校正目鏡測微尺
目鏡測微尺，如圖2，是一塊可放入接目鏡內的圓形小玻片，其中央有精確的等分刻度，一般有等分為50小格和100小格兩種。測量時(shí)，需將其放在接目鏡中的隔板上，用以測量經(jīng)顯微放大后的細胞物象。由于不同顯微鏡或不同的目鏡和物鏡組合放大倍數不同，目鏡測微尺每小格在不同條件下所代表的實(shí)際長(cháng)度也不一樣。
圖2目鏡測微尺
2.血球計數板測定微生物數量的原理血細胞計數板是一塊特制的載玻片，其上由4條槽構成3個(gè)平臺。中間較寬的平臺又被一段橫槽隔成兩半，每一邊的平臺上各刻有一個(gè)方格網(wǎng)，每個(gè)方格網(wǎng)共分9個(gè)大方格，中間的大方格即為計數室。計數室的刻度一般有兩種規格，一種是一個(gè)大方格分成25
個(gè)中方格，
而每個(gè)中方格又分成16小方格（圖5-2）；另一種是一個(gè)大方格分成16個(gè)中方格，而每個(gè)中方格又分成25個(gè)小方格，但無(wú)論是哪一種規格的計數板，每一個(gè)大方格中的小方格都是2400個(gè)。每一個(gè)大方格邊長(cháng)為1mm，則每一個(gè)大方格的面積為1mm，蓋上蓋玻片后，蓋玻片
3與載玻片之間的高度為0.1mm，所以計數室的容積為0.1mm（10-4mL）。以25個(gè)中方格的計數板為例，設5個(gè)中方格中的總菌數為A，菌液稀釋倍數為B，則：
1mL菌液中的總菌數=A/5×25×10×B圖3血球計數板側面及兩種類(lèi)型的計數室
三、實(shí)驗
1.菌種枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)斜面培養物；釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)液體培養基培養物。
2.溶劑和試劑
合成培養基（酵母菌液），稀釋的美藍染液（0.01%），95%酒精，二甲苯溶液，香柏油，無(wú)菌水
3.儀器和其他用品
血球計數板，顯微鏡，載玻片，酒精燈，接種環(huán)，蓋玻片，擦鏡紙，鏡臺測微尺，目鏡測微尺，無(wú)菌毛細滴管，雙層瓶，計數器
四、實(shí)驗步驟
1、微生物大小的測定（1）裝目鏡測微尺
取出接目鏡，把目鏡上的透鏡片旋下，將目鏡測微尺刻度朝下放在目鏡鏡筒內的隔板上，然后旋上目鏡透鏡，再將目鏡插入鏡筒內。（2）校正目鏡測微尺
�、俜喷R臺測微尺
將鏡臺測微尺刻度面朝上放在顯微鏡載物臺上。②校正
先用低倍鏡觀(guān)察，將鏡面測微尺有刻度的部分移至視野中央，調節焦距，當清晰的看到鏡臺測微尺的刻度后，轉動(dòng)目鏡使目鏡測微尺的刻度與鏡臺測微尺的刻度平行。利用移動(dòng)器移動(dòng)鏡臺測微尺，使兩尺在某一區域內兩線(xiàn)完全重合，然后分別數出兩重合線(xiàn)之間鏡臺微尺和目鏡微尺所占的格數
�、塾嬎�
由于已知鏡臺測微尺每格長(cháng)10μm，根據下列公式即可分別計算處在不同放大倍數下，目鏡測微尺每個(gè)所代表的長(cháng)度。
目鏡測微尺每個(gè)長(cháng)度（μm）=
用同樣的方法換成高背景和油鏡進(jìn)行校正，分別測出在高倍鏡和油鏡下，兩重合線(xiàn)之間兩尺分別所占的格數。(注意：觀(guān)察時(shí)光線(xiàn)不宜過(guò)強，否則難以找到鏡臺微尺的刻度；換高倍鏡和油鏡校正時(shí)，務(wù)必十分細心，防止接物鏡壓壞鏡臺微尺和損壞鏡頭。)（3）對枯草芽孢桿菌用簡(jiǎn)單染色法制片（4）菌體大小的測定
�、倏莶菅挎邨U菌大小的測定
目鏡測微尺校正完畢后，取下鏡臺測微尺，換上細菌染色制片。先用低倍鏡和高倍鏡找到標本后，換油鏡測枯草芽孢桿菌的寬度和長(cháng)度。測定時(shí)，通過(guò)轉動(dòng)目鏡微尺和移動(dòng)載玻片，測出細菌直徑或寬和長(cháng)所占目鏡測微尺的格數。最后將所測得的格數乘以目鏡測微尺（用油鏡時(shí)）每格所代表的長(cháng)度，即為該菌的實(shí)際大小
�、诮湍妇笮〉臏y定測定酵母菌時(shí)，先將酵母菌培養物制成水浸片，然后用高倍鏡或油鏡測出寬和長(cháng)各占目鏡微尺的格數，最后，將測得的格數乘上目鏡微尺（用高倍鏡或油鏡時(shí)）每格所代表的長(cháng)度，即為酵母菌的實(shí)際大�。ㄗ⒁猓嚎蛇x擇有代表性的3~5個(gè)細胞進(jìn)行測定；細菌的大小需用油鏡測定，以減少誤差）
�。�5）測定完畢，取出目鏡測微尺后將接目鏡放回鏡筒，再將目鏡測微尺和鏡臺測微尺分別用擦鏡紙擦拭干凈，放回盒內保存。2、顯微鏡直接計數法（1）鏡檢計數室
在加樣前，先對計數板的計數室進(jìn)行鏡檢。若有污物，則需清洗，吹干后才能進(jìn)行計數。（2）加樣品
將清潔干燥的血細胞計數板蓋上蓋玻片，再用無(wú)菌的毛細滴管將搖勻的釀酒酵母菌懸液由蓋玻片邊緣滴一小滴，讓菌液沿縫隙靠毛細滲透作用自動(dòng)進(jìn)入計數室，一般計數室均能充滿(mǎn)菌液（注意：要搖勻菌液；加樣時(shí)計數室不可有氣泡產(chǎn)生）（3）顯微鏡計數
5min，然后將血細胞計數板置于顯微鏡載物臺上，先用低倍鏡找到計數室所在位置，然后換成高倍鏡進(jìn)行計數。調節顯微鏡光線(xiàn)的強弱適當，對于用反光鏡采光的顯微鏡還要注意光線(xiàn)不要偏向一邊，否則視野中不易看清楚計數室方格線(xiàn)，或只見(jiàn)豎線(xiàn)或只見(jiàn)橫線(xiàn)。（4）清洗血細胞計數板
完畢后，將血細胞計數板在水龍頭用水沖洗干凈，切勿用硬物洗刷，洗完后自行晾干，鏡檢，觀(guān)察每小格內是否有殘留菌體或其他沉淀物。若不干凈，則必須重復洗滌至干凈為止。
五、實(shí)驗結果
1．菌體大小的測量
(1)目鏡測微尺校正結果
(2)枯草芽孢桿菌測量結果（油鏡觀(guān)察，所得數據為所占格數）
(3)釀酒酵母測量結果（油鏡觀(guān)察，所得數據為所占格數）
(4)測量結果換算
2、顯微鏡直接計數法（血球計數板）結果
六、思考題
1．為什么更換不同放大倍數的目鏡或物鏡時(shí)，必須用鏡臺微尺重新對目鏡測微尺進(jìn)行校正？答：因為目鏡測微尺每格代表的長(cháng)度與物鏡倍數不是成比例的增加
2．在不改變目鏡和物鏡測微尺，而改用不同放大倍數的物鏡來(lái)測定同一株細菌的大小時(shí)，其測定結果是否相同？為什么？
答：相同。因為改變物鏡放大倍數后，只要經(jīng)校正計算出正確的目鏡測微尺每格代表的長(cháng)度，再進(jìn)行測量，經(jīng)計算都會(huì )得到菌的實(shí)際大小。
3．根據你的體會(huì )，說(shuō)明用血細胞計數板計數的誤差主要來(lái)自哪些方面?應如何盡量減少誤差．力求準確?
答：①樣品的濃度要適中，太濃則不易計數，太稀也會(huì )導致計數不準確。另外稀釋時(shí)要精確。
�、跇悠废♂尯笠獡u勻，否則計數板每個(gè)格內的細菌數菌量分布不均，會(huì )造成較大誤差。
4．某單位要求知道一種干酵母粉中的活菌存活率，請設計1～2種可行的檢測方法。
答：將干酵母粉制成酵母菌液，取少量菌液于試管內并加入少量美藍染液進(jìn)行混合，然后在血球計數板進(jìn)行觀(guān)察計數，算出所有死活菌的總數量，然后觀(guān)察計數變藍的死的菌量，兩者比就是干酵母粉中的活菌存活率。
七、實(shí)驗小結
本實(shí)驗成功的關(guān)鍵是：
1.使用鏡臺測微尺進(jìn)行校正時(shí)，若一時(shí)無(wú)法直接找到測微尺，可先對刻尺外的圓圈線(xiàn)進(jìn)行準校后再通過(guò)移動(dòng)標本推進(jìn)器進(jìn)行尋找。
2.細菌在不同的生長(cháng)時(shí)期細胞大小有時(shí)會(huì )有較大變化，注意選擇處于對數生長(cháng)時(shí)期的細胞材料。
3.實(shí)驗中進(jìn)行顯微計數時(shí)應先在低倍鏡下尋找大方格的位置，找到計數室后將其移至視野中央，再換高倍鏡觀(guān)察和計數。
通過(guò)此次實(shí)驗，我們了解了血細胞計數板的構造及計數原理，掌握了用測微尺測定微生物細胞大小和使用血細胞計數板進(jìn)行微生物計數的方法，鞏固了微生物實(shí)驗技能。
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