微生物轉化技術(shù)應用詳細介紹

微生物轉化技術(shù)應用詳細介紹

　　微生物轉化是通過(guò)微生物細胞將復雜的底物進(jìn)行結構修飾，也就是利用微生物謝過(guò)程中產(chǎn)生的某個(gè)或某一系列的酶對底物特定部位(基因)進(jìn)行的催化反應。以下是小編整理的微生物轉化技術(shù)應用詳細介紹，希望對大家有所幫助。

　　1.概述

　　在過(guò)去的30多年中，微生物轉化或酶轉化技術(shù)在有機化學(xué)合成領(lǐng)域中的嘗試不僅使理論研究獲得廣泛開(kāi)展，在實(shí)際應用方面也取得了長(cháng)足的進(jìn)步。許多化學(xué)合成工藝相當復雜的藥物、食品添加劑、維生素、化妝品和其它一些精細化工產(chǎn)品合成過(guò)程中的某些重要反應，目前已經(jīng)能夠用微生物或酶轉化技術(shù)得以替代。

　　這些具有生物催化劑作用的酶大多數對其微生物的生命過(guò)程也是必需的，但在微生物轉化過(guò)程中，這些酶僅作為生物催化劑用于化學(xué)反應。由于微生物產(chǎn)生的這些能夠被用于化學(xué)反應的大多數生物催化劑不僅能夠利用自身的底物及其類(lèi)似物，且有時(shí)對外源添加的底物也具有同樣的催化作用，即能催化非天然的反應，因而微生物轉化可以認為是有機化學(xué)反應中的一個(gè)特殊的分支。某種特殊的微生物能夠將某種特定的底物轉化成為某種特定的產(chǎn)物，其本質(zhì)是酶的作用。因此，對酶轉化無(wú)需多作解釋?zhuān)�它與微生物轉化的差別僅在于：前者是一個(gè)單一的酶催化的化學(xué)反應，而后者為了實(shí)現這一酶催化反應，需要為微生物提供一個(gè)能夠生物合成這些酶的條件，因此，從這一角度來(lái)看，這似乎是真正的生物轉化。

　　另外，盡管用于生物轉化的酶大多來(lái)自于微生物，但也可以是來(lái)自于動(dòng)物和植物的酶。而對于一個(gè)具體的生物轉化來(lái)說(shuō)，究竟是采用微生物轉化技術(shù)，還是采用酶轉化技術(shù)，這要綜合考慮實(shí)現這一過(guò)程的諸多因素，如成本、環(huán)境、技術(shù)裝備和質(zhì)量要求等。在研究一個(gè)微生物(或酶)轉化過(guò)程時(shí)，需要仔細地考慮諸多方面的問(wèn)題如：所用轉化底物的選擇、所用微生物對不同底物轉化能力的考察、轉化路線(xiàn)或轉化反應的選擇等。其中最主要的是尋找適合于所設計轉化過(guò)程的微生物，以及如何來(lái)提高這種微生物的轉化能力，即提高這種酶活力。再則是發(fā)現一種新的酶或一種新的反應以便為設計一個(gè)新的微生物轉化過(guò)程提供一條線(xiàn)索。為了尋找能夠適合作為生物催化劑的微生物酶，除了有必要對原來(lái)已知的一些重要的酶或反應進(jìn)行重新評價(jià)外，一種更為有效的方法是篩選新的微生物菌株或酶。用于微生物轉化的菌株或酶的篩選的范圍應該盡可能地廣，因為至目前為止已經(jīng)發(fā)現了3000余種能夠催化各種化學(xué)反應的酶，其中有些酶的催化效果比化學(xué)催化劑好；另外，微生物的多樣性和其生理生化特性的多樣性(它們能夠修飾和降解許許多多有機化合物)，使我們有可能找到某種微生物或酶來(lái)催化某種特定的和所期望的化學(xué)反應。

　　2.生物轉化與藥物開(kāi)發(fā)的應用

　　愈來(lái)愈多的研究表明，作為治療用藥物的外消旋體混合物有著(zhù)不可避免的缺點(diǎn)，而美國FDA公布的手性藥物指導原則無(wú)疑加快了從頭開(kāi)始開(kāi)發(fā)單一異構體藥物或利用外消旋體轉換技術(shù)從已有的藥物中開(kāi)發(fā)單一異構體藥物的步伐。手性藥物制備的關(guān)鍵技術(shù)是不對稱(chēng)合成技術(shù)。多年來(lái)，有機化學(xué)工作者已經(jīng)研究開(kāi)發(fā)了許多種用化學(xué)的方法進(jìn)行不對稱(chēng)合成的技術(shù)，但近20多年來(lái)，很多長(cháng)期從事化學(xué)合成研究的工作者對微生物和酶反應發(fā)生了興趣，與此同時(shí)，很多長(cháng)期從事微生物和酶的研究的工作者對如何將此應用于有機合成發(fā)生了興趣，從而使生物催化轉化成為一種進(jìn)行不對稱(chēng)合成的重要技術(shù)。

　　應用生物催化轉化技術(shù)進(jìn)行不對稱(chēng)合成與化學(xué)合成法相比較具有的優(yōu)越性有：

　　1)轉化底物某一基團的專(zhuān)一性強，即對不需要轉化的基團無(wú)需保護；

　　2)通過(guò)對用于某一轉化的微生物進(jìn)行菌種選育和轉化條件的優(yōu)化，可以得到極高的轉化率；

　　3)生物催化轉化的反應條件溫和且對環(huán)境的污染很小。特別是近年來(lái)DNA重組技術(shù)的應用和新的轉化系統的開(kāi)發(fā)應用，使愈來(lái)愈多的原來(lái)使用化學(xué)方法進(jìn)行不對稱(chēng)合成的化合物有可能被生物催化轉化的方法來(lái)替代。

　　利用生物轉化技術(shù)進(jìn)行手性藥物的開(kāi)發(fā)主要進(jìn)行兩個(gè)方面的工作：一是進(jìn)行藥物關(guān)鍵中間體的制備，因為利用生物催化轉化方法制備對映體純化合物具有很大的吸引力，但試圖利用這種方法來(lái)完成所期望的復雜的有機合成往往是困難的，甚至是不可能的，而利用這種方法獲得某一關(guān)鍵中間體是切實(shí)可行的；另外，盡管用化學(xué)的方法能夠在實(shí)驗室條件下獲得所需要的手性藥物，但往往是由于成本和技術(shù)問(wèn)題難以實(shí)現產(chǎn)業(yè)化。因此用化學(xué)生物化學(xué)的制備路線(xiàn)具有獨特的優(yōu)越性，即所謂的“綠色合成工藝”；二是進(jìn)行消旋化合物的生物拆分或轉化，得到單一構型的藥物分子。

　　3.組合生物催化與新藥發(fā)現組合

　　生物轉化(催化)，是指利用一種以上的具有特殊轉化功能的微生物或酶，對同一個(gè)母體化合物進(jìn)行組合轉化，以得到化學(xué)結構的多樣性，它是從已知化合物中尋找新型衍生物以及從簡(jiǎn)單化合物制備復雜化合物的有效手段。從某種角度講，它比化學(xué)合成的方法更為簡(jiǎn)單和有效。這是一個(gè)新的研究領(lǐng)域。天然產(chǎn)物的多樣性和其結構的復雜性，是存在于生物體內大量酶的作用結果。生物體內負責一系列重要生命活動(dòng)的酶，在體外同樣具有相同的催化能力。因此，只要體外的催化環(huán)境與體內相仿，則能夠實(shí)現一系列復雜的，特別是用傳統化學(xué)合成方法難以實(shí)現的化學(xué)反應。利用生物催化劑或化學(xué)合成酶催化相結合的方法，能夠大大地增加衍生物的多樣性，以及能夠有效地對復雜天然產(chǎn)物的結果修飾和從簡(jiǎn)單的分子構建新的化合物庫，在這過(guò)程中，往往能夠發(fā)現新的生理活性物質(zhì)。生物催化劑為擴大組合化學(xué)提供了各種合成的可能性。

　　利用生物催化發(fā)現先導化合物的優(yōu)越性在于：

　　1)可能進(jìn)行反應的范圍廣；

　　2)能夠定向進(jìn)行區域選擇性和立體選擇性；

　　3)不需基團保護和脫保護，一步實(shí)現所需的反應；

　　4)在溫和和均一的條件下可容易地實(shí)現自動(dòng)化和一步反應的重現性；

　　5)溫和的反應條件保證了復雜易變的分子結構的穩定性；

　　6)高的催化活性可以降低催化劑的用量；

　　7)酶的固定化可以使催化劑反復和循環(huán)使用；

　　8)生物催化劑可在環(huán)境中完全被降解。

　　4.近年來(lái)一些相關(guān)課題的進(jìn)展

　　4.1甾體類(lèi)微生物轉化的研究甾體藥物包括激素類(lèi)藥物和非激素類(lèi)藥物：前者如性激素、類(lèi)皮質(zhì)激素和蛋白同化激素等；后者有抗細菌和抗腫瘤藥物等。由于其不可取代的用途及治療適應證不斷擴大，甾體藥物越來(lái)越引起人們的重視。利用生物轉化技術(shù)進(jìn)行甾體藥物生產(chǎn)主要有植物甾醇的邊鏈切除，以得到關(guān)鍵中間體ADD和4AD，以及進(jìn)行立體選擇性的羥化反應。

　　(1)利用微生物轉化切除邊鏈，制備甾體藥物關(guān)鍵中間體ADD和4AD微生物對甾體邊鏈的裂解轉化是一個(gè)很慢的過(guò)程，因為底物和產(chǎn)物的溶解性都很差，且底物傳遞至細胞的過(guò)程和產(chǎn)物傳出細胞的過(guò)程都很慢。因此，如何提高底物的溶解性一直是提高微生物轉化率的重要步驟。我國在微生物轉化菌株的菌種選育、轉化條件的優(yōu)化和轉化系統的研究方面進(jìn)行了數年的研究工作，最終已經(jīng)獲得了具有產(chǎn)業(yè)化價(jià)值的微生物轉化技術(shù)，即以天然維生素E生產(chǎn)下腳料(含有混合植物甾醇)為底物制備甾體藥物關(guān)鍵中間體ADD和4AD的工業(yè)化路線(xiàn)。

　　(2)利用微生物轉化選擇性羥基化，制備甾體藥物關(guān)鍵中間體11OHADD、11OH4AD，以及抗心衰新藥依普利酮關(guān)鍵中間體11OH坎利酮我們分別進(jìn)行了以ADD、4AD以及坎利酮為底物的微生物轉化菌株的篩選、選育，以及轉化條件的優(yōu)化等大量研究工作，最終獲得了具有產(chǎn)業(yè)化價(jià)值的微生物轉化制備工藝。

　　(3)利用微生物轉化技術(shù)，獲得多種4AD結構類(lèi)似物很多甾體藥物的關(guān)鍵中間體與4AD的結構類(lèi)似物有關(guān)，我們篩選了多種具有不同特性的微生物菌株對4AD進(jìn)行轉化，結果得到了一系列的4AD結構類(lèi)似物。

　　(4)利用微生物轉化技術(shù)，從植物混合甾醇直接生產(chǎn)睪酮在我們多年對植物甾醇微生物轉化邊鏈切除的研究過(guò)程中，發(fā)現了一個(gè)非常有意義的現象：即在經(jīng)過(guò)誘變處理的大量微生物轉化菌種中，發(fā)現了一株能夠直接將植物甾醇轉化成睪酮的菌株。同時(shí)，轉化條件的改變能夠使睪酮的轉化率大大地提高。進(jìn)一步的研究表明，能夠將植物甾醇直接轉化成大量睪酮的微生物菌株，其17羰基還原酶的活性比較高，因而將已經(jīng)轉化的ADD和4AD中17位的羰基還原成為羥基，分別獲得睪酮和去氫睪酮，以及另外一個(gè)17位邊鏈發(fā)生改變的結構類(lèi)似物。經(jīng)過(guò)大量的菌種選育工作和轉化條件的優(yōu)化工作，已經(jīng)獲得了一條利用微生物轉化直接從混合植物甾醇制備睪酮的工業(yè)化工藝路線(xiàn)。

　　4.2降糖藥物米格列醇的研究開(kāi)發(fā)米格列醇(miglitol)的發(fā)現源于對微生物發(fā)酵產(chǎn)物野尻霉素的研究，研究顯示該原來(lái)作為抗沙門(mén)氏菌的抗生素具有較強的α葡萄糖苷酶抑制作用，繼而成為第一個(gè)具有開(kāi)發(fā)價(jià)值的淀粉酶抑制劑。1脫氧野尻霉素(1deoxynojirimycin)由野尻霉素還原而得，也可由多種鏈霉菌和芽孢桿菌產(chǎn)生，同樣具有糖苷酶抑制作用。N取代1脫氧野尻霉素具有更好的降糖效果，米格列醇就是其中之一。米格列醇的結構與葡萄糖相似，能夠可逆地競爭性抑制假單糖α葡糖苷酶，減少單糖的代謝，降低在小腸的吸收。根據文獻報道，有多種制備米格列醇的化學(xué)合成工藝。其中有以6脫氧6氨基山梨醇為原料，經(jīng)雷尼鎳催化還原后，再與環(huán)氧乙烷反應而成。也可以先與環(huán)氧乙烷反應后，再在鈀碳催化下還原制得。另外，也有多種利用生物轉化和化學(xué)合成相結合的方法，以及先用微生物發(fā)酵制備野尻霉素或1脫氧野尻霉素后再用化學(xué)合成的方法來(lái)制備米格列醇。本中心研究開(kāi)發(fā)的米格列醇制備工藝采用生物轉化與化學(xué)合成相結合的方法，簡(jiǎn)要工藝流程如圖7所示。本制備工藝的關(guān)鍵是篩選具有高效氧化氨基葡萄糖的微生物菌株，以及能夠實(shí)現產(chǎn)業(yè)化的轉化工藝。

　　4.3降糖藥物伏格列波糖的研究開(kāi)發(fā)伏格列波糖是新一代的α葡糖苷酶抑制劑，最初是從某種放線(xiàn)菌培養液中發(fā)現的氨基糖類(lèi)似物，口服后能競爭拮抗性地抑制腸道內雙糖類(lèi)水解酶(α葡糖苷酶)，延緩糖尿病患者餐后血糖的迅速上升從而抑制餐后高血糖。同時(shí)伏格列波糖明顯降低身體的脂肪量，肥胖的減輕使胰島素受體敏感性增加，進(jìn)而使空腹血糖逐漸明顯下降。據文獻報道，伏格列波糖的制備除了通過(guò)全化學(xué)合成獲得外，還有以下幾條路線(xiàn)：一條路線(xiàn)是由有效霉素產(chǎn)生菌發(fā)酵，從發(fā)酵液中分離出大組分有效霉素A，經(jīng)生物轉化后得到關(guān)鍵中間體valienamine和validamine，再經(jīng)過(guò)化學(xué)合成即可得到終產(chǎn)物；或是從有效霉素發(fā)酵液中分離出小組分有效霉素G，生物轉化得到關(guān)鍵中間體valienamine和valiolamine，兩者經(jīng)適當步驟的化學(xué)合成反應后即可得到終產(chǎn)物；第二條路線(xiàn)是從有效霉素發(fā)酵液中分離出小組分valienamine，經(jīng)化學(xué)合成后得到終產(chǎn)物；第三條路線(xiàn)是從有效霉素發(fā)酵液中分離出小組分valiolone，同樣經(jīng)適當化學(xué)合成反應后得到終產(chǎn)物；第四條路線(xiàn)是由D葡萄糖經(jīng)一系列的化學(xué)反應直接合成得到終產(chǎn)物。

　　4.4N乙酰神經(jīng)氨酸的研究開(kāi)發(fā)N乙酰神經(jīng)氨酸(Neu5Ac)是合成抗病毒藥物扎那米韋的前體，其本身也具有多種重要的應用價(jià)值。目前有三種不同的生物轉化方法制備：途徑Ⅰ是一個(gè)相對簡(jiǎn)單的醛縮反應；途徑Ⅱ涉及到反應前體ManNAc的磷酸化；途徑Ⅲ所合成的產(chǎn)物Neu5Ac9P需要進(jìn)一步用另外的酶脫磷酸化。這些合成方法均可在體外進(jìn)行，目前已經(jīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)的是途徑Ⅰ。

　　目前易采用途徑Ⅰ的生物轉化方法，首先從E.coliC600中成功地擴增了N乙酰神經(jīng)氨酸裂合酶基因(nal)，通過(guò)同源性比較發(fā)現，它與來(lái)源于E.coliK12的nal序列完全一致。氨基酸序列比對結果表明，136和164位的氨基酸也為賴(lài)氨酸和酪氨酸，與文獻報道的活性中心位點(diǎn)一致。進(jìn)而，將該基因通過(guò)EcoRI和BamHI兩個(gè)酶切位點(diǎn)，嚴格控制起始密碼子和啟動(dòng)子間距離的情況下克隆到高表達載體pYG5上，構建成新的質(zhì)粒pLY2，并進(jìn)行其表達研究。然后對粗酶的制備、轉化條件的優(yōu)化、分析檢測方法的建立，以及產(chǎn)物的分離純化等進(jìn)行了研究，初步獲得了一條適合工業(yè)化生產(chǎn)N乙酰神經(jīng)氨酸的路線(xiàn)。

　　微生物的指示作用

　　(1)著(zhù)生的緣毛目多時(shí)，處理效果良好，出水BOD5和濁度低。(如小口鐘蟲(chóng)、八鐘蟲(chóng)、溝鐘蟲(chóng)、褶鐘蟲(chóng)、瓶累枝蟲(chóng)、微盤(pán)蓋蟲(chóng)、獨縮蟲(chóng))這些緣毛目的種類(lèi)都固定在絮狀物上，并隨窗之而翻動(dòng)，其中還夾雜一些爬行的棲纖蟲(chóng)、游仆蟲(chóng)、尖毛蟲(chóng)、卑氣管葉蟲(chóng)等，這說(shuō)明優(yōu)質(zhì)而成熟的活性污泥。

　　(2)小口鐘蟲(chóng)在生活污水和工業(yè)廢水處理很好時(shí)往往就是優(yōu)勢菌種。

　　(3)如果大量鞭毛蟲(chóng)出現，而著(zhù)生的緣毛目很少時(shí)，表明凈化作用較差。

　　(4)大量的自由游泳的纖毛蟲(chóng)出現，指示凈化作用不太好，出水濁度上升。

　　(5)如出現主要有柄纖毛蟲(chóng)，如鐘蟲(chóng)、累枝蟲(chóng)、蓋蟲(chóng)、輪蟲(chóng)、寡毛類(lèi)時(shí)，則水質(zhì)澄清良好，出水清澈透明，酚類(lèi)去除率在90%以上。

　　(6)根足蟲(chóng)的大量出現，往往是污泥中毒的表現。

　　(7)如在生活污水處理中，累枝蟲(chóng)的大量出現，則是污泥膨脹、解絮的征兆。

　　(8)而在印染廢水中，累枝蟲(chóng)則作為污泥正�；蚋纳频闹甘旧�物。

　　(9)在石油廢水處理中鐘蟲(chóng)出現是理想的效果。

　　(10)過(guò)量的輪蟲(chóng)出現，則是污泥要膨脹的預兆。

　　另在一些對原生動(dòng)物不宜生長(cháng)的污泥中，主要看菌膠團的大小用數量來(lái)判斷處理效果。變形蟲(chóng)（阿米巴）amoeba顧名思義，變形蟲(chóng)是能變形的。不過(guò)這種變形也是有限度的。

　　一些種類(lèi)的變形蟲(chóng)能向四外伸出假足，以探查水中的化學(xué)成分，決定移動(dòng)方向。而有些種類(lèi)根本沒(méi)有假足。

　　他們獵食時(shí)覆蓋它的獵物，把獵物裹起來(lái)，這樣就產(chǎn)生了一個(gè)食物泡，食物泡可以消化吸收獵物。

　　大多數變形蟲(chóng)對人體無(wú)害,但有幾種變形蟲(chóng)能產(chǎn)生人類(lèi)疾�。喊⒚装土〖�，主要發(fā)生在貧窮國家。

　　微生物的定義

　　什么是微生物呢？所謂微生物是指個(gè)體微小，必須借助于顯微鏡才能看清它們外形的一群低等的、原始的微小生物，如細菌。（體型微小，必須借助于光學(xué)顯微鏡或電子顯微鏡才能看到它們的結構，結構簡(jiǎn)單，有的具有細胞構造，有的甚至沒(méi)有細胞構造，生長(cháng)繁殖快，對物質(zhì)具有非常強烈的轉化作用；容易引起變異，以致微生物的種類(lèi)特別繁多，并且新的種類(lèi)還在不斷產(chǎn)生；數量多，分布廣，對自然環(huán)境的適應性強，以致在自然界的任何地方如土壤、空氣、水以及人和動(dòng)植物體上都有微生物生活或生存）

　　微生物的特點(diǎn)

　　微生物是結構簡(jiǎn)單、繁殖快、分布廣、個(gè)體最小的生物。

　　1、結構簡(jiǎn)單：微生物多數是單細胞；

　　2、生長(cháng)旺，繁殖快（大腸桿菌在它的適宜37-44℃之間，20-30分鐘繁殖一代）

　　3、分布廣、種類(lèi)多（10萬(wàn)多種）：自然界中到處都有，如水、空氣、土壤等。

　　4、個(gè)體�。盒∮�0.1mm。在形態(tài)上，個(gè)體微小，肉眼看不見(jiàn)，需用顯微鏡觀(guān)察，細胞大小以微米和納米計量。

　　5、適應性強，易變異。相對于高等生物而言，較容易發(fā)生變異。在所有生物類(lèi)群中，已知微生物種類(lèi)的數量?jì)H次于被子植物和昆蟲(chóng)。微生物種內的遺傳多樣性非常豐富。

　　6、代謝活性強，轉化快。

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